Hepatology（IF 17.425）| 明尼苏达大学Revelo教授团队通过单细胞转录组揭示肠道菌群加重脂肪肝的潜在机制

非酒精性脂肪肝（NASH）正迅速成为肝移植和肝衰竭的首要原因。肝炎是NASH的关键特征，但参与这一过程的免疫通路尚未充分阐明。B细胞是适应性免疫系统的细胞，是免疫反应的关键调节剂。然而，B细胞在NASH发病机制中的作用以及导致它们在肝脏中激活的潜在机制尚不清楚。美国明尼苏达大学Xavier Revelo教授等研究团队在Hepatology（IF 17.425）上发表了一项题为“Microbiota‐driven activation of intrahepatic B cells aggravates NASH through innate and adaptive signaling”的研究，该研究从单细胞转录组出发，并结合肠道菌群的多样性，运用多组学技术联合，系统阐述肠道微生物群驱动的B细胞积累和活化会在NASH进展过程中通过先天性和适应性免疫机制导致肝脏炎症和纤维化。

 研究材料

高脂肪高碳水化合物饮食小鼠模型（HFHC）、正常饮食小鼠（NCD）、B细胞缺陷型μMT小鼠、B细胞特异性缺失MyD88 (B-MYD) 的小鼠、Nur77-GFP小鼠、FMT小鼠

 技术路线

步骤1：HFHC饮食诱导的NASH小鼠肝脏中存在促炎性B细胞的聚集和活化，而B细胞缺陷小鼠的肝脏炎症和纤维化得到改善；

步骤2：MyD88是B细胞在NASH过程中促进肝脏炎症、纤维化和损伤所必需的；

步骤3：NASH中的B细胞活化受到B细胞受体信号，提示B细胞活化整合了天然免疫和适应性免疫机制;

步骤4：移植NASH患者粪菌增加了受体小鼠肝脏中的B细胞积累和活化，从而加剧NASH，提示肠道菌群因素驱动了B细胞在NASH中的致病性。

 研究结果

1. B细胞在NASH中的动态变化

为了确定肝内B细胞在NASH进展中的作用，作者用HFHC饮食诱导小鼠NASH，并分离出免疫细胞后识别主要的免疫细胞群，HFHC组的B细胞显著增加。为了评估B细胞中细胞因子的表达情况，作者发现分别在丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）和脂多糖（LPS）刺激后，NASH小鼠表达TNF-α和IL-6的B细胞数量增加。同时，来自NASH小鼠的B细胞也显示出细胞表面主要组织相容性复合物 (MHC) I类和II类以及CD86的上调，这表明活化和抗原呈递能力增加。以上结果表明，NASH小鼠中肝内B细胞积累，并释放促炎细胞因子以及呈递抗原的能力增加。

图1 促炎性B细胞在NASH小鼠的肝脏中积累

2. NASH小鼠肝内B细胞显示促炎基因谱

为了更好地了解NASH如何改变B细胞的转录组谱，作者对来自NCD和HFHC肝脏的免疫细胞进行了单细胞转录组测序，发现24个CD45+免疫细胞簇。作者主要关注了B细胞簇的基因表达谱，发现炎症基因Il1b、S100a8等在HFHC肝脏B细胞中表达增加。为了验证单细胞转录组对B细胞表达谱的检测能力，作者还对HFHC和NCD小鼠肝脏B细胞进行了常规RNA-seq，同样验证了几个促炎基因在HFHC肝脏B细胞中上调。为了解释这些数据的生物学意义，作者使用 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 来检测基因表达模式，发现参与炎症和TLR信号传导的上游调节因子的激活，以及IL10RA和SOCS1的抑制，并且富集到活跃的炎症途径。以上结果显示NASH小鼠的B细胞活化和炎症表型增加。

图2 肝内B细胞在NASH期间显示出促炎基因谱

3.  B细胞缺陷可改善NASH

为了确定B细胞是否在NASH的发病机制中起直接作用，作者评估了HFHC喂养的B细胞缺陷μMT小鼠的NASH进展。HFHC μMT小鼠显示出NAS评分较低，且转录组数据表明，在HFHC μMT小鼠中，促炎基因的表达显著降低，B细胞数目显著减少，并且HFHC μMT小鼠纤维化明显减少，纤维化形成基因表达降低，而这些变化在NCD WT和NCD μMT小鼠中并未检测到，该结果说明在HFHC喂养后，B细胞可以引起代谢和炎症紊乱。

图3 B 细胞缺乏可改善NASH期间的炎症和纤维化

4.  促炎基因MyD88介导NASH中B细胞的促炎功能

RNA-seq分析确定MyD88是HFHC小鼠肝B细胞中促炎基因的上游调节因子，为了研究B细胞固有的MyD88信号传导是否影响NASH进展，作者构建了B细胞特异性缺失 MyD88 (B-MYD) 的小鼠，HFHC喂养后发现B-MYD HFHC小鼠NAS评分较低。虽然B-MYD HFHC和WT HFHC小鼠之间的总数和亚群免疫细胞群没有差异，但B-MYD HFHC小鼠的肝内B细胞MHC-I和MHC-II减少，这表明TLR介导的激活降低了抗原的呈递能力。以上结果表明，B细胞需要MyD88来促进NASH的肝脏炎症、纤维化和损伤。

图4 MyD88介导NASH中B细胞的炎症功能

5.  BCR刺激激活肝内B细胞

BCR与抗原结合产生的激活信号是B细胞活化的第一信号，接下来作者探究了在NASH过程中肝内B细胞的激活是否与BCR信号有关，因BCR信号传导在Nur77基因的控制下诱导绿色荧光蛋白 (GFP) 表达，作者给Nur77-GFP小鼠喂食NCD或HFHC，结果发现HFHC Nur77-GFP小鼠的GFP+肝内B细胞的频率和数量显著增加，表明在NASH期间的激活涉及肝脏中的BCR信号。该结果表明，NASH中，B细胞的活化受到BCR信号刺激。

图5 B细胞通过BCR被激活

6.  肠源性微生物因子促进肝内B细胞活化

为了研究NAFLD相关菌群失调产生的细菌产物是否促进肝内B细胞活化，作者构建了FMT小鼠模型，与健康FMT小鼠相比，NAFLD FMT小鼠表现出拟杆菌门和变形菌门丰度增加，该结果与NAFLD供体的菌群比例具有高度相似性。且NAFLD FMT小鼠NAS评分略有增加，肝内B细胞数量增加，抗原呈递和共刺激分子的表达增加，纤维化轻微增加。这些数据表明，肠道菌群中与NAFLD相关的变化足以诱导肝脏中B细胞的积累和活化，同时将肝脏病理学的各个方面从人类供体传递给受体小鼠。

图6 肠源性微生物因子促进肝内B细胞活化

 结论

文章首先通过单细胞转录组测序对NASH样本进行免疫分析，发现促炎B细胞在NASH样本中显著积累，随后作者利用B细胞缺陷型小鼠模型证明了B细胞在NASH进展中的重要性，接下来作者相继证明了B细胞促炎表型受到MyD88和BCR信号的调节刺激。通过FMT实验进一步证明了NASH患者肠道菌群的改变可以导致肝脏中B细胞积累和激活。文章运用多组学技术联合，系统的阐释了肠道菌群对NASH的影响，在基础医学和临床上具有深远的意义。