实验1：总RNA的提取——Trizol

实验一：细胞中总RNA的提取及鉴定

一、目的：
掌握Trizol提取总RNA的原理和步骤，学习电泳鉴定总RNA的方法。
二、原理：
RNA是核酸，具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。
常用的试剂为Trizol，该试剂可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。
三、步骤：

1. 细胞中总RNA的提取
   （1）80~90%汇合的生长状态良好的贴壁细胞弃培养基后按3ml/10cm 直径培养皿贴壁细胞加入Trizol，反复吹打至液体完全透明，室温放置5min。
   （2）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。
   （3）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。
   （4）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min。
   （5）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。
   （6）用1ml 75%乙醇（DEPC水，现用现配）洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。（7）4℃离心，8,000rpm，5min。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。 注： RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
   （8）可用50ul H2O（根据RNA量，可以适当调整），TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-20℃（最好-80℃）。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
   2．RNA的琼脂糖凝胶电泳
   1）用1×TBE电泳缓冲液制作1.5%琼脂糖凝胶，加1×TBE电泳缓冲液覆盖凝胶。
   2）取RNA样品3μl于封口膜上及2μl 的6×加样缓冲液，混匀后，用微量移液器小心加入点样孔。
   3）打开电源开关，调节电压至110V，使RNA由负极向正极电泳，约20min后将凝胶放在凝胶成像仪上观察RNA电泳结果。
   四、 注意事项：
   1．所用耗材均为去RNA酶材料；
   2．注意带口罩和手套，避免RNA降解；
   3．加样准确。

   
   
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