1. Single-cell analyses show unique cardiac macrophage subsets.
Fig 1a： 对心脏CD45+CD64+CD11b+巨噬细胞的分析提示新生鼠出生14天后心脏只存在一个CCR2–MHC-IIlo macrophage subset，而成年鼠(>12周)心脏中检测到了额外的CCR2+MHC-IIhi 和 CCR2–MHC-IIhi巨噬亚群。
CCR2+MHC-IIhi 和 CCR2–MHC-IIhi巨噬是从CCR2–MHC-IIlo巨噬分化来的？
Fig 1b： To quantify monocyte dependence, we paired Ccr2−/− mice (Rosa26+/+), which lack circulating Ly6Chi monocytes, with Ccr2+/+ mice, which carried a constitutively expressed gene encoding the membrane-localized TdTomato (Td) reporter in the Rosa26 locus (Rosa26mTmG/mTmG; R26 mTmG), for 6 months. 流式结果显示Ccr2−/− 鼠的心脏组织中大多数CCR2+ macrophages (>80%) 和一小群CCR2–MHC-IIhi macrophages (~25%) 被循环中Ccr2+/+ (Td+)单核起源的巨噬所取代，而CCR2–MHC-IIlo巨噬则只有少部分(~12% Td+)被替换。
共生鼠是吧，也不画个示意图...正常情况下Ccr2−/− 鼠心脏巨噬全是无荧光的，当Ccr2−/− 鼠和CCR2+(Td+)鼠血供相通后，Ccr2−/− 鼠心脏中来自循环的外周巨噬细胞和由血供补充的组织CCR2+组织原位巨噬都会带红光。
Fig 1c-e： 由于心脏中还存在着可以表达巨噬marker的异质性的DC (cDC1 and cDC2)，随后作者分选了成年鼠心脏CD45+CD64+CD11b+巨噬和CD45+CD64−CD11c+MHC-IIlo–hi树突，1:1混合之后进行了单细胞测序。得到1780个细胞，分为11个群。包括4个巨噬群(1, 2, 3, 5)，一个单核群(4)，两个cDC群(CD209a cDC2, cluster 7; and XCR1 cDC1, cluster 8) 和一个DCs (9) 以及两个增殖群 (10a, 10b) 和一个APC群(6)。
Fig 1f： 四群巨噬中，1群被定义为Timd4 cluster、2群诶定义为Mhc-II cluster、 3群被定义为Ccr2 cluster、5群被定义为Isg cluster。
Fig 1g： 富集分析提示Timd4 群主要参与稳态和再生功能包括endocytosis, lysosome function, angiogenesis and regeneration等。其他群也有各自的功能。
2. Single-cell trajectories reveal developmental relationships.
为了确定单核细胞和巨噬细胞亚群之间的分化关系，作者对他们了重新降维（图2a），并计算了伪时间轨迹。分析表明Timd4群中的巨噬细胞占据了一个单独的轨迹分支（图2b）。Ccr2和Isg群以及单核细胞占据了第二个分支（图2b），而Mhc-II群中的巨噬细胞跨过了所有三个分支（图2b）。Mpath算法显示了类似的排序，并表明Isg巨噬可能来自Ccr2巨噬，而不是单核细胞（图2c），Monocle得到了类似的结果（图2d）。
然后使用Monocle可视化了基因表达随时间轴的变化，以跟踪不同巨噬细胞状态的变化。Klf2、Mafb和Maf在Ccr2群中表达较低，在Mhc-II群中较高，在Timd4群中进一步增加（图2e,f），表明这些转录因子与心脏巨噬细胞的命运有关。MHC-II群下调的基因，Cx3cr1和Il1b与Timd4、Lyve1和Igf1在Timd4群中的表达增加有关（图2e,f）。相比之下，Ccr2、Mhc-II和Isg群似乎构成了一个相关谱系组，Isg群采取了独特的激活状态，集中在I型IFN信号的周围。Tracking gene expression changes across macrophage states revealed coordinated patterns defining macro- phage subset identification and functions.
3. Cx3cr1-based mapping tracks resident cardiac macrophage fate.
Fig 3a： 为了追踪不依赖于血液单核细胞的心脏巨噬，作者使用了tamoxifen诱导的Cx3cr1CreERT2–IRES–YFP (termed Cx3cr1CreER–YFP) 和 Rosa26-stop- TdTomato reporter mice (termed Cx3cr1CreER–YFP:R26Td)。
Fig 3b： 作者对3周小鼠给予了10天tamoxifen-containing chow，随后给了normal chow for 1–10 weeks。在给tamoxifen之前，CD115+CD11b+Ly6c+外周血单核几乎没有Td+细胞 (<0.2%)。在给予tamoxifen之后，外周血Ly6c+ blood monocytes迅速出现大量Td+细胞 (92–95%)。而在停止给tamoxifen2-3周后又回到了baseline (<0.5%)。超过90%的CD11b+CD64+总心脏巨噬在给予tamoxifen后快速变成Td+。而在5w之内，CCR2-心脏巨噬持续Td+，而CCR2+心脏巨噬在停止tamoxifen后逐渐丢失了Td表达，consistent with replacement of CCR2+ macrophages by unlabeled monocytes.
Studies have shown robust tamoxifen-inducible reporter gene expression in Cx3cr1-expressing resident macrophages and transient labeling of blood monocytes
Fig 3c： 随后作者在tamoxifen停止20w后的小鼠心脏中，根据单细胞筛选出来的组织原位巨噬细胞marker进行了检测。CCR2–MHC-IIloTIMD4+心脏巨噬仍保持着很高的Td+(~90%)，CCR2–MHC-IIhiTIMD4−巨噬约 ~75% Td+，CCR2+MHC-IIhiTIMD4– 巨噬则约 15–20% Td+。
Fig 3d： 共生鼠的结果则显示CCR2–MHC-IIloTIMD4+巨噬 had very little donor chimerism (~2%)，CCR2–MHC-IIhiTIMD4−巨噬with ~20% chimerism by parabiosis，CCR2+MHC-IIhiTIMD4– 巨噬 with almost complete chimerism (~90%) in parabiotic studies.
Thus, CCR2 expression alone identified a subset of cardiac macrophages that were fully replaced by blood monocytes in adult mice, and by stratifying the remaining macrophages by TIMD4 and MHC-II, we identified macrophage subsets with limited monocyte dependence.
4. Resident macrophages are lost within infarcted myocardium.
Fig 4a： 为了探究组织原位巨噬在无菌性炎症中的动态变化，作者使用了心梗模型。作者对3w大Cx3cr1CreER–YFP:R26Td小鼠给予了10天tamoxifen，六周后小鼠被用于心梗造模。之后作者对ischemic zones (infarct and peri-infarct tissue) 和 remote (noninfarcted) zones进行了流式检测。
Fig 4b： 结果显示和对照相比，造模2天后梗死区resident Td+ macrophages绝对数包括CCR2−MHC-IIloTIMD4+ 和 CCR2−MHC-IIhiTIMD4–)减少了～60%，而在随后的时间里(days 4–28)其绝对数逐渐增加。而recruited Td− macrophages数量下降。
Fig 4c-d： 然而梗死后4周，resident macrophages 和 recruited macrophages 的比例并没有恢复到梗死前的水平。
Fig 4e： 在steady state下，原位CCR2−MHC-IIhiTIMD4–巨噬～75%是Td+，而梗死后只有～5%仍然是Td+，提示招募的巨噬占了绝大部分。与此相反，baseline时，CCR2−MHC-IIloTIMD4+巨噬～90%是Td+，梗死后2d和28d下降到～75%，indicating that TIMD4 expression was maintained on resident Td+ macrophages and recruited macrophages did not become TIMD4+, even at 28 d after infarction.
Fig 4f： 免疫荧光结果也提示梗死两天后梗死区的Td+ cardiac macrophages丢失了70%, with a progressive increase in density over 28 d.
Fig 4g, h： 随后作者使用BrdU检测了巨噬细胞增殖情况，结果显示巨噬细胞在心脏梗死后2-4天增殖最强。
5. Recruited cardiac macrophage plasticity in infarcted tissue.
随后作者对梗死后11天心脏梗死区巨噬进行了单细胞测序，得到了11种细胞，有7群是在梗死心脏特有的，而且它们主要来源于 Td–单核细胞。7群中有4群是巨噬(8-11)，1群DC(7)。特有的四群巨噬促炎功能显著更强。轨迹分析揭示了单核向巨噬的分化过程，随着这个过程，一些缺氧相关基因也出现上调。
6. Cardiac macrophage heterogeneity in human cardiomyopathy.
作者对心梗患者的心脏巨噬也进行了分析，得到了三群：CCR2−MHC-IIhi, CCR2+MHC-IIhi 和 CCR2+MHC-IIlo。同样的，人CCR2−MHC-IIhi群表达在小鼠组组织原位细胞中检测到的marker如TIMD4, LYVE1, CD163, FOLR2, IGF1 和 MAF (f附件)。
Thus, CCR2 defines recruited monocytes and monocyte-derived macrophages in both mouse models and human cardiomyopathy.
7. Cx3cr1-based depletion post-infarct worsens cardiac function.
最后，作者使用Cx3cr1CreER–YFP:R26Td/DTR鼠来标记组织原位巨噬并使用白喉毒素来选择性的清除resident Td+ cardiac macrophages。结果显示清除了组织原位巨噬的小鼠梗死更重，死亡率更高。