CITE-seq：同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序

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单细胞测序方法和原理系列：

• 1. 单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics
• 2. DNA文库构建和Illumina测序化学原理
• 3. 单细胞免疫组库：TCR基因重排原理和TCR测序建库方法
• 4. 单细胞ATAC-seq原理介绍与报告解读

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1. 介绍

CITE-seq是一种能够同时测定数千个细胞的无偏差转录图谱和基于抗体检测的蛋白标记物的技术。研究发现，这种方法可以同时适用于两种不同的高通量单细胞测序，并通过实例显示出，该方法比单独的单细胞测序数据能够得到更加详细的细胞表型特征。
CITE-seq这个方法在2017年的时候发表在nature methods上。作者还建了一个网站：www.cite-seq.com

ADT (antibody derived tags)概念：被测序测到的“从抗体衍生出来的标签”的数量。可以近似地认为，ADT就是抗体所对应的蛋白在一个细胞上的表达量。但要注意的是，这里只是一个近似值，因为不同抗体对抗原的亲和力是不一样的。

2. CITE-seq原理

CITE-seq由mRNA测序和对带标签的抗体测序组成。单细胞测序的部分和10X的原理是一样的，参考：单细胞转录组建库原理：SMART、TargetAmp和10X genomics 。只是CITE-seq在原有单细胞测序的基础上加了抗体，抗体可以结合到细胞表面相应的蛋白上，抗体上带有特殊的DNA标签。

带有DNA标签的抗体：
抗体的设计使得它1）能够被基于寡聚dT建库的RNA文库所捕获；2）含有用于区分抗体条形码序列；3）能够进行后续的PCR特异扩增。
使用链霉素-生物素亲和反应将抗体与寡核苷酸的5’端连接起来，同时还包含了一个二硫键，于是在还原条件下寡核苷酸便能够从抗体上释放出来。

首先将抗体和单细胞悬液一起孵育（和流式类似），抗体和细胞结合后洗去未结合的抗体，随后样本即可对接10x技术被分成油包水小液滴。

细胞裂解后，mRNA和与抗体结合的寡核苷酸通过它们3’端的polyA尾巴，同时与含有polyT的微珠发生退火而结合在一起。在反转录时，与微珠结合的一段特殊的条形码序列能够区分来自于不同细胞的mRNA和与抗体结合的寡核苷酸序列。而扩增了的来源于抗体的序列（ADTs）和cDNA分子能够通过大小区分开，并将其构建为独立的Illumina测序文库。

需要注意的是，两个文库类型是可以同时进行测序的，但考虑到测序深度问题，由于它们是单独构建的，因此可以将它们合并在单一泳道中并调整它们的相对比例，以确保每个文库都能获得适当的测序深度。
文库制备好之后就可以进行测序了

3. 优点

1. 同时测mRNA+蛋白信息，数据更丰富，对细胞的注释更准确，有助于发现新的细胞类型。
2. 由于barcode的存在，CITE-seq检出的mRNA+蛋白是可以对应的，可就是说是可以同时得到每个细胞的mRNA+蛋白表达量。
3. 与流式细胞相比，CITE-seq又可以不受抗体之间信号干扰的影响，大大增加了表面蛋白标记的数量(一次可以检出多达100个的蛋白)，从而可以一次性获得多种由抗体蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果关注点在细胞蛋白上，ADTs可以独立于细胞的mRNA而单独测序、分析，即已报到的Abseq。
4. CITE-seq能够与10X Genomics无缝衔接，方便易操作。

参考：
CITE-seq可以同时测细胞表面蛋白和RNA的单细胞测序
Total-seq的前世今生——前世：CITE-seq