如何利用线粒体DNA进行物种鉴定？

答：

（1）物种特异性PCR方法，设计基因（如Cyt b，D-loop区等）的物种特异性引物进行扩增鉴定；

（2）PCR-RFLP，这是一种简单的鉴定物种间和物种内遗传多样性的方法，目前，常采用的基因序列有Cyt b基因序列，tRNAGlu/Cyt b、16S rRNA/tRNA Val序列，12S rRNA基因序列，D-loop区序列，以及12S rRNA基因和D-loop区之间的序列。虽然PCR-RFLP方法精确可靠，但该方法不仅成本高，而且耗时；（限制性酶切片段多态性）

（3）序列分析，与其他基于PCR的方法相比，序列分析是最真实的方法，近几年，研究人员利用D-loop区的序列分析成功地区别了中国梅花鹿亚种；

（4）PCR法，M Galan等运用PCR方法将赤路与狍毛发样品DNA提取物的一段D-loop区序列进行扩增，成功地区别了这两种动物的毛发。

D-loop区作为整个线粒体基因组中核酸序列和长度变异最大的区域，是线粒体基因组长度变异的主要原因，拷贝数不仅存在种间差异，种内个体间也存在差异，且已被多项研究证明其用于物种鉴定的可靠性。因此相对于基因组庞大且复杂的真核基因组，线粒体基因组结构简单，序列较短，既含有保守区也含有高变区，因此适合于不同进化程度的物种的分类鉴定。

除了D-loop区之外，线粒体上的一些保守基因也可以用于物种鉴定，如Cyt b等，但对于种属差异性比较小，比如亚种的鉴定，选用变异性较大的D-loop区更为合适。

线粒体DNA控制区(又称D一环区，displacement loop region)是线粒体DNA中的一段非编码区，位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间，结构较为复杂，分为3个区段：终止序列区、中央保守区和保守序列区。可能由于缺乏编码的压力，控制区进化速度相对较快，其序列的变异不仅有核苷酸之间的替换，还有不同长度核苷酸序列的缺失、插入或不同拷贝数的串联重复，是线粒体DNA序列和长度变异最大的区域。

更多案例解答：

Q1：如何研究细菌的耐药机制？

A1：有些耐药基因，未必是常规的数据库可以搜索到的，因为这些基因可能是行使其他功能的，只是发生了点突变，导致蛋白质构象改变，从而导致药物的作用靶标位点不存在，导致脱靶。可以从两个层面研究，一是DNA层面，包括两个角度，直接搜索数据库，找到直接相关基因，另外是进行SNP分析，找到新的耐药相关基因；第二个层面是在转录组层面，看看加药物前后的基因变化情况。

Q2：进化树上数字大小，即bootstrap表示什么？

A2：表示两个枝聚在一起的可靠性，这个数值越大，说明越支持这两枝分成两类，比如80，就代表80%的聚类结果都支持将这两支聚在一起，这些数字代表支持率，因此是没有什么单位的。

Q3：不同生物中的rRNA种类？

A3：真核生物的rRNA种类有5s，5.8s，18s，28s，原核生物的rRNA种类有5s，16s，23s。

在低等植物叶绿体核糖体中,rRNA分子通常只有23S、16S 和5S 三种,与原核生物核糖体基本相同。但是,70年代后期在高等植物叶绿体核糖体中,还发现了另一种小分子 RNA—4.5S rRNA。

Q4：细菌有哪些分泌系统？

A4：致病性细菌通过分泌系统分泌蛋白毒素进入外界环境或直接作用于真核细胞靶位点，使宿主致病。迄今为止,已发现了Ⅰ-Ⅸ型分泌系统。从Ⅰ型到Ⅸ型（T1SS到T9SS）。Ⅰ-Ⅵ型分泌系统主要存在于革兰氏阴性菌。Ⅰ型和Ⅲ型是不依赖信号肽（sec）的，Ⅱ型和Ⅳ型是sec依赖性的。Ⅳ型也存在于革兰阳性菌中;Ⅶ型则存在于革兰阳性菌中。Ⅶ型分泌系统是近年来发现的一种特殊分泌系统,能介导病原微生物毒力蛋白分泌,与宿主相互作用,并参与细菌体内锌铁平衡等,在革兰阳性菌的生长代谢及致病过程中发挥重要作用。

Ⅲ型分泌系统主要与细菌致病性有关，结构：T3SS注射装置。通常由30-40Kb的基因编码，以毒力岛形式存在于细菌染色体或质粒上。GC含量低，编码基因成簇存在，可在细菌间传递。大多数细菌只有1套Ⅲ型分泌系统，少数如鼠伤寒沙门氏菌则有2套完全独立的分泌系统，在感染不同阶段发挥作用。

与病原菌致病相关的分泌系统有：Ⅲ型，Ⅳ型，Ⅵ型，Ⅶ型。

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