单细胞RNAseq揭示存在EGFR突变的早期肺腺癌中的肿瘤异质性和免疫细胞群
今天解读的这篇9+的文章也是刊登在《Oncogene》杂志上，该期刊是生化与分子生物学”子行业的优秀级杂志，居于一线期刊。其收稿要求涵盖了癌基因的结构和功能的各个方面，尤其是: 细胞癌基因及其激活机制，其编码蛋白的结构和功能，DNA和RNA的癌基因，肿瘤病毒，人类肿瘤的分子肿瘤学，肿瘤抑制基因，生长调控基因，细胞周期控制生长因子和受体细胞凋亡。中科院大类：医学1区 中科院小类：生物与分子生物学。
为了更好的理解文章思路，仍首先以思维导图的形式对文章进行概括总结。
发现问题：
携带EGFR基因突变的肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）在亚洲人群患者中较普遍存在，而目前仍未在单细胞分辨率上解决患者间和肿瘤内的异质性。
解决方法：
研究人员对来自7个携带EGFR突变的I/II期LUAD样本和5个癌旁肺组织样本的共计125,674个细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。
结果解读：
7例携带EGFR突变的LUAD样本的scRNA-seq分析
研究人员收集到的7例未经治疗的早期(I/II期)LUAD患者(LUAD 1-7)的肿瘤组织均携带最常见的EGFR激活突变，即L858R点突变和第19外显子缺失(表1)。为进行比较，还分析了分别与LUAD1-LUAD5匹配的5个肿瘤旁正常肺组织的细胞。从158,306个细胞中获得了约43亿个独特的转录本，每个细胞检测到1147个基因。经过数据处理和标准化及数据过滤，获得了125,674个细胞用于后续分析。
所有细胞进行无监督的聚类后得到32个不同的簇(图1b)，通过UMAP降维后进行可视化。然后分析每个簇中经典Markers的表达和差异表达基因（DEGs），并用热图形式展示出每个细胞类型中TOP5 DEGs，（筛选标准：p≤0.05, fold change≥1.5）(图1c)，并将细胞分型：肿瘤细胞、支气管/肺泡上皮细胞、髓系细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和肥大细胞(图1b，c)。
scRNA-seq结果显示：基质细胞中占比最多的细胞类型为髓系细胞和T淋巴细胞，研究人员还采用免疫组织化学染色法（IHC）进行蛋白水平的研究，结果与测序结果一致，也显示肿瘤样本中存在大量巨噬细胞和T淋巴细胞。
图1.对照组织和携带EGFR突变的LUAD样本的scRNA-seq
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）处于具有促肿瘤功能的中间极化状态
研究人员接下来研究LUAD早期样本中TAMs的特征。将髓样细胞分为14个不同的亚群，发现大约90%的髓样细胞是CD68+的巨噬细胞(图2a，b)，而CD11B+(ITGAM)的巨噬细胞表达不高。与癌旁正常组织相比，TME中树突状细胞（DCs）增多，粒细胞减少(图2a)，且与正常组织中的巨噬细胞相比，TAMs显著高表达APOE和SPP1 (图2c)，而该两种蛋白被认为能促进肿瘤细胞的生长和侵袭。TAMs的 DEGs进行GO_BP富集分析，发现这些DEGs参与的生物学过程主要与细胞外基质分解、对缺氧的反应、胆固醇外流的正调节以及对TNF和IL1B的反应有关(图2d)，表明这些DEGs可能促进细胞迁移、血管生成、肿瘤进展和炎症。此外，研究人员还发现了一个高表达细胞周期相关基因的TAM群体(图2b中的集群8)，例如NUPR1，STMN1和MKI67，并用抗CD68和-Ki67抗体进行IHC验证这些增殖性巨噬细胞的存在(图2e)。为了了解LUAD早期TAMs的极化，对所有CD68+的巨噬细胞进行经典激活巨噬细胞(M1)和替代激活巨噬细胞(M2)特异性基因的检测 (图2f：红色为M1型标记基因；蓝色为M2型标记基因)，结果发现，TAMs和正常肺源性巨噬细胞都没有表现出特异性的M1或M2特征，但它们具有相似的M1和M2特征基因的表达水平 (Pearson相关系数=0.16)，表明它们既具有极化特征，又处于M1和M2状态之间的各种中间极化状态(图2g)。综上所述，虽然早期LUAD中的TAMs似乎表达促进肿瘤发生的基因，但它们还没有明显的M1和M2极化。
图2.TAMs具有促肿瘤功能，并处于中间极化状态
早期LUAD具有免疫抑制T淋巴细胞和树突状细胞群
研究人员发现T细胞约占所有非恶性细胞群体的20-60%，但无偏聚类后并未发现在肿瘤样本和正常组织样本间存在不同的T细胞簇(图3A)，故研究人员对每个簇的T细胞亚型进行分析。分析了每个簇中T细胞亚型标志物的表达情况，结果发现，肿瘤浸润T细胞高表达调节性和耗竭标记，如TIGIT，LAYN，FOXP3和CTLA4，而正常组织中的T细胞高表达效应性和初始T细胞标志(图3b, c)。此外研究人员还发现了一种增殖T细胞亚型(第7簇，高表达Ki67)，该亚型既表达效应性T细胞特征(例如，GZMA)，也显示了功能失调的标记物，如LAG3、TIGIT和PD-1，表明肿瘤细胞毒活性受损(图3d)。
TME中T细胞亚型的丰富程度与检查点阻断治疗的预后密切相关，而TME中的DCs在介导T细胞趋化、分化和活化过程中发挥重要作用。研究人员发现，LUAD中的DCs主要是具有抑制效应性T细胞和促进调节性T细胞功能的CD1C+的DC (图3d，e)。综上所述，研究结果提示，早期LUAD具有免疫抑制作用，T细胞分化为调节性和耗竭性T细胞亚型，并伴有CD1C+DC的增多。
图3. LUAD的TME富含调节性和耗竭的T细胞，并伴有CD1C+DC的增加
早期LUAD内的肿瘤细胞有不同的表达特征
为了进一步验证对上述结果，研究人员使用癌旁组织中已被注释的肺上皮细胞作为背景对照，从15,414个基因在潜在恶性细胞的每条染色体上的表达强度推断出大规模的拷贝数变异(CNVs)。CNVs异常的细胞被鉴定为恶性细胞(图4a)，根据DEGs的功能富集（GO_BP）分析，进一步将其分为8个簇(图4b)，对每个簇中的DEGs进行KEGG_Pathway富集分析，结果显示这些簇中的DEGs分别富集到缺氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻译起始、细胞周期和抗原递呈等途径(图4c)。此外，研究人员发现早期LUAD内的肿瘤细胞中经典的AT2细胞标记物SFTPC或Clara细胞标记物SCGB1A1除了在第3簇的细胞群体中高表达外，其余簇中均未高表达，但发现Clara细胞前体标志物SCGB3A2和肺泡上皮祖细胞（AEP）标志物TM4SF1在肿瘤细胞中表达上调(图4d，e)，即表示肿瘤细胞同时高表达近端和远端上皮祖细胞标志物，肿瘤细胞由具有不同细胞系表达谱的性群体组成。
图4早期LUAD内的肿瘤细胞具有不同的基因表达特征
拟时间序列分析表明ELF3在高级别的肿瘤细胞中表达上调
上述结果显示了不同的肿瘤细胞群，其DEGs富集到了不同的Pathway上，表明它们之间进展的异质性。接下来，研究人员试图用scRNA-seq获得LUAD进展过程中分化状态的时间信息。
作者汇集了所有的恶性肿瘤细胞(图1b)，并使用Monocle3R软件包构建了单细胞假时间轨迹。Monocle3对所有肿瘤细胞进行降维，并根据它们的进展状态对细胞进行排序。作者在第3簇的细胞内手动设置假时间轨迹的根状态，因为它们仍然表达正常的肺上皮标记，如肺泡2型(AT2)细胞标记SFTPC和Clara细胞标记SCGB1A1，这表明它们仍然是正常肺上皮细胞的特征。然后，在计算每个单元的伪时间值之后获得伪时间轨迹(图5a)。利用Monocle3的图形测试功能，作者确定了在时间轨迹内在更高级的细胞中上调的基因。尽管它们位居榜首，但长的非编码RNA(LncRNAs)MALAT1和NEAT1已经被定性为肺癌和其他恶性肿瘤[36，转移的标志。作者注意到，更多的改变基因编码结构蛋白，如膜通道(例如APQ3)和转运蛋白(例如SLC34A2和NPC2)，这些蛋白可能与肿瘤细胞中的关键调节因子偶联。作者特别感兴趣的是那些与癌症进展、TME信号和不良预后相关的基因，如LY6E、NAPSA、MUC1、ELF3和FOS (图5b)。它们中的一些在肺癌中有很好的特征。例如，NAPSA是LUAD的常见预后标志物。LY6E、MUC1和FOS在多种肿瘤的免疫逃逸和抑制性免疫微环境中起重要作用。在这项研究中，作者决定将重点放在ELF3的作用上，ELF3是一种调节肺上皮细胞发育的转录因子，它与气道炎症有关，并在前列腺癌和结直肠癌中介导炎症信号和肿瘤进展。为了研究ELF3在LUAD中的作用，作者使用了TCGA LUAD数据(n=515)，发现与正常肺组织相比，ELF3在肿瘤样本中上调(图5c)。此外，TCGA数据集的基因集富集分析(GSEA)显示，在ELF3表达水平较高的肿瘤中，CCND1和AKT上调的基因集过表达(图5d)。综上所述，这些结果提示ELF3在较晚期的LUAD细胞中表达上调，并与LUAD中CCND1和AKT的表达上调有关。
图5 IL1B诱导后ELF3通过PI3K/Akt/NFκB信号通路促进肿瘤生长
ELF3可以调节非小细胞肺癌和化学诱导的肺损伤中的细胞周期和增殖。ELF3的高表达还通过激活丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB途径促进肿瘤生长。鉴于NF-κB通路在激活癌细胞存活基因和免疫细胞炎症反应中起重要作用，作者推测ELF3可能是LUAD中NF-κB通路的重要调节因子。作者首次证实，与正常肺组织相比，肿瘤组织中ELF3的蛋白水平上调(图6a)。然后，作者用实时定量聚合酶链反应(qRT-κ)检测了ELF3和NF-ELFB靶基因在另外12例LUAD组织中的表达。作者发现ELF3在所有肿瘤组织中的表达均高于匹配的正常组织。一些NF-κB靶基因如CCND1、BCL2L1和GADD45Band ICAM1在肿瘤组织中也表达上调(图6b)。由于TME的其他细胞类型，特别是免疫细胞也高度表达NF-κB靶基因，作者决定使用LUAD细胞株A549和NCI-H1975来进一步研究ELF3在肿瘤细胞中的功能。用siRNAs敲除ELF3后，NFKB1的表达没有变化(图6c)。BCL2L1、CCND1和PTGS2在两种细胞系中表达下调，而其他负责血管生成(即VEGFA)和转移(即MMP9)的基因没有变化(图6c)。基因表达的降低至少部分是由于PI3K/AKT/NF-κB通路失活所致，因为PI3K、AKT、IKA和P65的磷酸化蛋白在ELF3基因敲除后都降低了(图6d)。
已知免疫细胞分泌的促炎细胞因子如白细胞介素1B和肿瘤坏死因子ɑ可在不同细胞类型中激活NF-κB途径。为了确定ELF3是否参与了LUAD细胞中NF-κB通路的激活，作者首先用IL1B处理A549和NCI-H1975细胞。作者发现ELF3和与细胞存活和炎症相关的NF-κB靶基因如BCL2L1、CCND1、PTGS2和ICAM1(图6e)的表达上调，当ELF3在两个细胞系中被击倒时(图6f)，ELF3的表达受到抑制(图6f)。应该注意的是，根据宇宙细胞系项目数据库，A549和NCI-H1975细胞没有CCND1扩增，CCND1扩增出现在约3.64%的TCGA LUAD队列中。作者推测了11号染色体上CCND1的一些拷贝数增加，除了ELF3介导的转录调控外，可能还与其在某些肿瘤细胞中的过表达有关。综上所述，肿瘤微环境中的促炎细胞因子IL1B可上调LUAD肿瘤细胞中ELF3的表达，从而增强NF-κB通路的激活，从而有利于肿瘤细胞的存活和生长。作者的结果提示，LUAD肿瘤细胞中的ELF3可能成为阻止肿瘤生长的一个新的治疗靶点。
图6 ELF3可由IL1B诱导，并通过PI3K/AKT/NF-κB途径促进肿瘤生长。
本文小结：
这项工作为了解亚洲患者中携带EGFR突变的早期LUAD的异质性和免疫细胞谱提供了宝贵的资源。作者确定了包括ELF3在内的关键基因，以介导肿瘤细胞与其TME成分之间的相互作用，这表明ELF3可能成为LUAD中未来药物发现的治疗靶标。文章 - 生信人 (biosxr.cn)