细胞RNA提取的操作步骤

操作步骤  （请自行准备无水乙醇、异丙醇、灭菌 1.5mL 离心管） ：

1. 取出洗涤液，按以下操作：

a) 洗涤液 A：按终浓度 30%比例加入无水乙醇，如 7mL 加入 3mL 无水乙醇；21mL 加入 9mL 无水乙醇，充分混匀。

b) 洗涤液 B：按终浓度 70%比例加入无水乙醇，如 3mL 加入 7mL 无水乙醇；9mL 加入 21mL 无水乙醇，充分混匀。

c) 配制好的洗涤液如出现沉淀，可在 37℃溶解，摇匀后使用。

2. 取 1.5mL 离心管，加入 200μL 细胞样本，再加入 180μL 裂解液及 20μL 消化液，振荡混匀，65℃水浴 10 分钟。

3. 加入 400μL 异丙醇，混合均匀，如有半透明悬浮物，不影响 RNA 的提取与后续实验。

4. 将吸附柱放入收集管内，将上述溶液转入吸附柱内，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液；

5. (可选步骤，去除DNA) 取 RNase-free 离心管 1 只，每份需去除 DNA 的提取样本分别加入 10x DNase I Buffer 6μL、RNase-free ddH2O52μL 、RNase-free DNase I2μL，轻轻手振混匀，勿剧烈震荡。用移液器在每份提取样本的吸附膜中央加入 60μL 上述配制好的 DNase I反应液，室温放置 15min。

6. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

7. 将吸附柱放回收集管内，加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。

8. 按每份样本 40μL 取洗脱液（如 10 份提取样本，即取 400μL 洗脱液），放置于灭菌 1.5mL 离心管，65℃预热。

9. 将吸附柱放回收集管内，12,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。

10. 取出吸附柱，放入新的 1.5 mL 灭菌离心管内，在吸附柱中心加入 40 μL 预热洗脱液，静置 2 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 RNA溶液。提取的 RNA 即可用于下一步实验或-70℃保存。

注意事项：

1. 裂解液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。

2. 由于 RNA 容易降解，提取实验所用器具应除去 RNA 酶，实验过程中最好戴一次性洁净手套、口罩，提取的 RNA 溶液可适当加入 RNA保护因子。

3. 洗涤液加入乙醇后要充分混匀，最好现用现配，每次根据所要提取的样本量计算后适量配制。

4. 所用细胞量建议不高于 10 7 ，洗涤液在使用前请加入无水乙醇后充分混匀。