二代建库流程详解

越来越多的科研学者使用二代测序（Next-Generation Sequencing）进行自己课题研究，很多科研人员选择将样本直接寄送到二代测序科服公司进行实验。很多人可能并不了解文库构建的完整流程，今天小编就给大家介绍几种常见文库构建的流程。

一. DNA建库流程：

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DNA建库的完整流程：

1. 基因组DNA片段化：由于目前测序仪读长有限，如双端各测150bp或75bp等，可采用酶打断和超声打断两种方式，酶打断操作更方便，更节省时间，但目前酶打断还有一定的偏好性，超声打断还是主流打断方式；

2. 末端修复：打断后的DNA末端会有粘性末端，需要进一步补平成平末端；

3. 加A：与接头T互补配对，增加接头连接效率；

4. 加接头：接头是一段固定序列，能够与芯片配对发生成簇反应，可分为长接头（index在接头上，index区分不同文库样本），短接头（index通过PCR引入）；

5. 磁珠纯化：一般此步骤采取两步磁珠纯化，根据磁珠优先吸附大片段原理，通过使用不同体积磁珠，第一步磁珠纯化去除大片段，第二步磁珠纯化去除小片段，从而得到合适片段长度文库；

6. PCR扩增：通过接头引物扩增富集文库；

7. 磁珠纯化：纯化文库；

8. 文库质检：一般先用Qubit进行文库定量，然后使用2100仪器进行文库片段分析，通过qPCR进行绝对定量，混样上机。

二、 mRNA建库流程：

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1. mRNA分离：mRNA的3’端有Poly A结构，利用Oligo dT磁珠将mRNA从总RNA中拉出来。mRNA建库对RNA质量要求较高，一般要求RIN值大于7，RNA发生降解会引起只能捕获到mRNA 3’端信息，5’端信息会发生丢失；

2. mRNA片段化：一般使用Mg离子及高温打断，片段化长度与打断时间相关；

3. 一链二链合成：将mRNA先反转录成cDNA，再进行二链合成；

4. DNA建库：后续步骤和DNA建库步骤相同，只是不要打断步骤。

三、LncRNA建库流程

LncRNA建库流程与mRNA建库整体流程类似，只是第一步mRNA纯化改为rRNA去除，目前市面rRNA去除主要有四种方法：

1. 磁珠连接探针去除：通过碱基互补配对原理，对于rRNA序列有依耐性，不同物种使用不同探针类型；去除rRNA后后续建库流程与；

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2. DNA探针去除法I：根据rRNA序列设计特异性DNA探针，将探针与总RNA混合后进行退火延伸，rRNA会形成DNA/RNA双连结构，利用RNAase H降解嵌合链中RNA，再用DNA酶降解DNA探针，剩下mRNA及LncRNA建库流程与mRNA建库流程一致，此法也是基于rRNA序列，不同物种使用不同探针；

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3. DNA探针去除法II：先用随机引物进行一链合成，按建库流程构建单链文库，特异性DNA探针能与rRNA单链文库退货延伸，形成双链结构，在反向接头上带有特殊酶切位点，一旦形成双链结构，酶切位点能够被酶识别，将接头切除，rRNA不带有完整接头，mRNA及LncRNA带有完整接头，通过接头引物富集的即是mRNA及LncRNA信息，此法也基于rRNA序列，不同物种使用不同探针；

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4. 变形退火法去除rRNA：此法是目前最新研发出来的rRNA去除方法，不过目前市场用户还不多，效果还有待进一步验证。先使用随机引物进行一链合成，然后进行变性形成单链cDNA及单链RNA混合样本，加入特殊化学成分，能识别rRNA，促进rRNA与其对应的cDNA退火，而LcnRNA及mRNA则不会与cDNA退火，加入酶mix消化双链rRNA/cDNA，后面在进行常规的建库步骤。此原理不基于RNA序列，没有物种局限性。此原理还有待市场验证，如果效果理想将是rRNA去除突破性技术，可能会取代前三类rRNA去除技术。

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