文献学习036--[sc]SARS-CoV-2受体ACE2在人类心脏的细胞特异性表达

1. SARS-CoV2受体ACE2在肺脏的单细胞表达

上海同济大学医学院左为研究团队文章

虽然病毒入侵人体可能有多种不同方式，但通过呼吸道入侵肺部并引发重症肺炎仍是其致病最主要模式。人体肺脏是一个复杂的组织器官，包括二十三级的支气管分支和上亿的肺泡结构。肺泡内又有I型II型两类肺泡上皮细胞及伴行的血管内皮细胞，还有包括巨噬细胞在内的各种免疫细胞等。这任何一类细胞理论上均可能成为冠状病毒感染的靶细胞。以往的免疫组织学研究已经对ACE2受体在人体肺组织内的表达情况进行了分析，结论显示ACE2在人体I型肺泡、II型肺泡、支气管上皮和血管内皮等多种细胞均有表达。然而，众所周知免疫组织化学方法时常存在非特异性染色的问题，且在定量方面可信度不高。

基于此，该论文基于公开的数据库，利用单细胞RNA测序分析技术，对新型冠状病毒2019-nCOV的受体基因血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）在人体肺脏内每一个细胞的表达情况进行了分析，研究了共计四万三千多个细胞。
分析结论表明：80%ACE2 受体主要在肺内一小群 II 型肺泡聚集，这群对病毒易感的AT2细胞占所有AT2细胞数量的1.4%左右。这些AT2细胞不仅表达病毒受体，还高表达其它二十多个与病毒复制和传播密切相关的基因，说明其很可能正是冠状病毒感染的靶细胞。此外，基于个体人群的分析指向男性可能比女性表达更高水平的ACE2，而亚裔可能比其它人种表达更高水平的ACE2。但这些结果有待更大规模人群数据验证。

2. SARS-CoV-2受体ACE2在人类心脏的细胞特异性表达

A：作者对5个主动脉瓣狭窄 (aortic stenosis, AS)，2个射血分数减低的心衰(HFrEF)和1个正常对照的心脏进行了单细胞核测序。
B-D：得到57601个核，分为18个cluster。包括6个心肌细胞群，1个成纤维细胞群，3个内皮细胞群，2个白细胞群，1个周皮细胞群和1个平滑肌细胞群。(还有2个unknown)。D图中可以看到ACE2在心肌细胞和壁细胞(尤其是周皮细胞)表达，在成纤维，内皮和白细胞中也有低水平表达。
E：对不同细胞群比较了不同组间ACE2的表达。发现心肌细胞的ACE2在患者组显著升高，在内皮细胞增高不显著。在成纤维细胞中的表达则出现了显著下降。
F：免疫荧光验证了ACE2在AS患者心脏表达增加
G：除了ACE2，ACE在AS和HFrEF患者心肌细胞的表达也显著增加
H：有趣的是，给予ACE inhibitor治疗的患者，和ARB治疗的患者相比，心脏ACE2也显著更高。
I：此外，给予ACEI治疗的患者，存在着ACE和ACE2表达的imbalance，ACE/ACE2和正常心肌比高了4倍。

In conclusion, these data provide novel insights into the cell type-specific expression and regulation of ACE2 in the heart. Patients with varying heart disease aetiology show augmented expression of ACE2 levels particularly in cardiomyocytes. Treatment with ACE inhibitors tends to be associated with increased ACE2 mRNA and unfavourable ACE/ACE2 ratios, which are believed to be a driver of cardiovascular pathologies.

3. 人类心脏ACE2表达提示新冠患者心脏损伤的新机制

A：modelling和docking的结果提示SARS-CoV-2拥有可以和人ACE2很好的结合的receptor-binding domain (RBD)。The residues 441Leu, 472Phe, 479Gln, 480Ser, 487Asn, 491Tyr of mature spike protein appear to be critical for binding to the human ACE2 receptor and determining the host cellular range.

做法：

B：作者在GTEx数据库查看了人类器官中ACE2 mRNA的表达，小肠表达最高，其次是睾丸、脂肪组织、甲状腺、肾、心脏和结肠等。在肠道和肾的高表达可以解释患者粪便和尿液中存在病毒检出。心脏ACE2的表达比小肠低，但是高于肺脏。
C-D：作者对成人心脏进行了单细胞核测序。得到了8个主要细胞群

cardiomyocyte (CM): TTN, MYH7
endothelial cell (EC): VWF, PECAM
macrophage (MU): CD163, MRC1
fibroblast (FB): COL6A3, DCN
pericyte (Peri): ABCC9, KCNJ8
smooth muscle cell (SMC): MYH11, CALD1
T cell: SKAP1, BCL11B
previously unknown neuron-like cell (Neu): identified by NRXN1 and NRXN1

E：ACE2在心肌表达较低，在周皮细胞表达较高，提示周皮细胞是新冠病毒在心脏的主要靶细胞（和前面那一篇不一致哦）
F：周皮细胞群表达ABCC9和PDGFRB，低表达MYH11，也提示这一群是周皮细胞而不是平滑肌。

Different from SMCs that are located in the coronary arteries or arterioles, pericytes spread outside the endothelial cell of capillary and part of venules, which may play an essential role in myocardial micro-circulation

G：作者进一步查看了SARS-CoV2另外两个相关受体CD209和CLEC4M的表达，CD209主要在CD163阳性的巨噬细胞表达，CLEC4M没有测到。
H：随后作者以周皮细胞为配体细胞计算了细胞互作。结果提示中性粒细胞和内皮细胞与周皮细胞有很强的互作。
I：表达CD206的巨噬细胞和内皮细胞和T细胞有强互作。
提示SARS-CoV2可以攻击周皮细胞，进一步引起内皮损伤和心脏局部微环境紊乱
J-K：心衰患者转录和蛋白水平的ACE2都上调，和心脏有基础疾病患者感染新冠后症状更重相一致。

这个文章数据处理的时候把<800基因的细胞都滤掉了，选了1500个高变基因做PCA。后续分析选的PC数没有具体说，只是说根据Elbow plot确定的，看起来是原始数据质量不太好的样子。但是是个letter，也看不了数据质量和质控图。

⚠️关于上面的B图我有一个问题，SARS-Cov2主要攻击肺脏，引起ARDS，但肺的ACE2表达是非常低的，这是非常奇怪的，为什么SARS-Cov2会特异性攻击肺脏的ACE2呢？结合前面第一篇文献，肺中主要是II型肺泡上皮受到SARS-Cov2的攻击，但表达ACE2的AT2细胞只占所有AT2细胞数量的1.4%左右，为什么SARS-Cov2就只攻击AT2？是有什么别的机制参与其中吗？（与感染途径有关？）