中科院脑智卓越中心新型RNA编辑工具

姓名：王成                                                                                                                               学号：16140110062

学院：微电子学院

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【嵌牛导读】：Nature子刊发表中科院脑智卓越中心关于新型RNA编辑工具开发及其优化的研究成果

【嵌牛鼻子】：新型RNA编辑工具

【嵌牛提问】：新型RNA编辑工具在生物学上的应用有什么进展？

【嵌牛内容】：

    最近报导的Cas13系统都是从可培养的微生物基因组数据中挖掘的，然而自然界中90%的微生物都是不可培养的，因此，杨辉团队这次把目标聚焦在挖掘未获培养的自然微生物宏基因组数据。该研究通过精巧的计算生物学算法和实验设计，鉴定到了两个新的Cas13家族，并命名为Cas13X和Cas13Y，其中，Cas13X.1蛋白比常用的RfxCas13d蛋白还要小将近200个氨基酸，为目前最小的Cas13蛋白。通过对大量内源基因位点进行敲低实验，Cas13X.1展现了和RfxCas13d一样的高活性和高特异性。

  为进一步研究Cas13X.1在抗RNA病毒方面的应用潜力，团队成员分别对H1N1病毒和过表达的部分新冠病毒基因组上多个位点进行靶向切割，发现Cas13X.1在体外展现了良好的病毒抑制效果。最后，杨辉团队将突变的Cas13X.1与ADAR2dd进行融合，并做了一系列蛋白截短改造，开发了一种迷你型的RNA单碱基编辑工具，通过与之前报道的RNA单碱基编辑系统进行比较发现，基于迷你型Cas13X.1蛋白的RNA单碱基编辑系统（miniCas13X-ADAR2dd）可以对靶RNA进行高效的A到I和C到U的编辑。同时，miniCas13X-ADAR2dd比REPAIR和RESCUE系统小将近900aa，可以包装到一个AAV里面。此外，全转录组分析显示，迷你碱基编辑器脱靶活性极低，是一项高保真的碱基编辑技术。

  值得一提的是，目前Cas13系统应用于临床最大的障碍是Cas13蛋白本身的旁切活性(collateralactivity,靶RNA激活的非靶标RNA切割活性)。已有证据表明Cas13d的旁切活性会对动物细胞和个体产生一定毒副作用。虽然Cas13X.1在体外切割实验中显示了比Cas13a和Cas13d更低的旁切活性，但是Cas13X.1的进一步改进，以及体内的长期安全性评价，对于Cas13X.1的最终临床应用至关重要。

   该工作成功从未获培养微生物宏基因组数据中鉴定到了两个新的Cas13系统，极大地丰富了Cas13家族的多样性。而且通过大量实验证明了Cas13X.1在RNA编辑方面具有非常大的应用潜力，小尺寸很好地解决了Cas13体内递送的问题，有望在未来成为一种高效安全的RNA治疗方法，为疾病(尤其是罕见病)的基因治疗提供更多的选择。

  该项工作由中科院脑智卓越中心博士后胥春龙、周英思和博士研究生肖庆全、博士后贺冰冰与耿冠男等研究人员，在中科院脑智卓越中心杨辉研究员、周英思博士和中国农业大学农学院赖锦盛教授的指导下完成，研究组的博士后汪子康、董雪、研究生曹碧蓉和本科生王一凡等其他成员积极参与，并得到了脑智卓越中心流式分选和高性能计算集群平台的大力协助。本工作得到科技部、中科、国家基金委、上海市的资助。

  图1：从未获培养的自然微生物宏基因组数据挖掘新的Cas13蛋白应用于哺乳动物与病毒RNA的敲降。a, 构建新挖掘的Cas13X, Cas13Y蛋白与前人报道的Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d蛋白的进化树。括号展示了常见的Cas13蛋白及其大小。标尺展示了大小为0.5的相对遗传距离。b, Cas13X与Cas13Y相关CRISPR系统的基因座示意图。蓝色和绿色长方形分别表示Cas13和CRISPR重复单元。灰色菱形表示间隔序列。c,Cas13X.1介导高效的多重RNA敲降。d, 上, SARS-CoV-2与SARS-CoV-1以及 SARS-CoV-2 与所有冠状病毒基因组序列的比对结果. 中, SARS-Cov-2病毒RNA敲降的报告系。下, 病毒RNA敲降结果。

  图2：开发基于Cas13X.1的迷你型RNA碱基编辑器应用于高效的A到I和C到U碱基替换 a, 基于dCas13X.1的RNA腺苷酸编辑器xABE以及碱基编辑报告系统示意图。b, 预测的Cas13X.1 与ADAR2dd蛋白结构。黄色和绿色分别表示Cas13X.1的N端与C端, 红色代表HEPN基序, 橙色表示ADAR2dd。c,xABE截短突变体的效率检测结果。d,全长与迷你xABE及过去报道的ABE的A到I编辑效率的比较结果。e,全长与迷你xCBE及过去报道的CBE的C到U编辑效率的比较结果。f,迷你xABE/xCBE显著降低全转录组的RNA脱靶编辑。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41592-021-01124-4