单细胞分析（五）——使用Harmony进行数据整合和去批次

为什么要进行数据去批次

进行样本去批次（batch correction）是单细胞RNA测序数据分析的重要步骤之一。

技术噪声和批次效应： 单细胞RNA测序数据通常具有高度异质性，且在采样、实验操作、反应条件等多个环节中可能引入技术噪声和批次效应。这些因素会对测序数据质量产生影响，从而使得不同批次数据之间存在较大的差异。

批次效应的干扰：不同批次数据之间的差异会掩盖真正的生物学差异，从而影响后续的分析结果。例如，在聚类分析中，如果没有进行批次校正，就很容易把来自不同批次的细胞划分到不同的亚群中。

提高可比性和统计功效：去除批次效应可以提高不同实验之间的数据可比性，也可以增加数据之间的统计功效，从而更好地发现生物学上的差异和特点。

因此，为了保证单细胞RNA测序数据的准确性和可靠性，需要对数据进行样本去批次处理。去批次的方法包括Harmony，SeuratV3等，这些方法可以有效地消除批次效应和技术噪声，并提高单细胞RNA测序数据的质量，为后续的数据分析提供更加可靠的基础。

数据分次读入

使用GSE135337这个数据集中的数据进行分析

将数据处理成seurat对象 格式，然后保存后，进行分析比较，直接读入，进行分析。

data1 <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BC1.RDS')
data2 <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BC2.RDS')
data3 <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BC3.RDS')
data4 <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BC4.RDS')
data5 <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BC5.RDS')
data6 <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BC6.RDS')
datan <- readRDS('./output_data/GSE135337_scobj/BCN.RDS')

### 把数据变成list
data <- list(data1, data3, data4, data5, data6, datan)

多个数据整合

Merge 合并数据

### Merge 合并数据
scobj <- merge(x=data[[1]], y = data[-1], project = "scBC")

## 删除所有data前缀的数据,释放空间
rm(list = ls(pattern="data.*"))

数据去批次处理

在去批次处理之前，需要主成分分析降维后的数据，因此还需要把这一部分数据进行统一降维

数据质控

质控过程中seurat对象保存的metadata中，nFeature_RNA, number of Feature, 每个细胞中有多少个基因，nCount_RNA, number of counts, 每个细胞中有多少个counts，percent.mt, 自己增加的列, 每个细胞中线粒体基因的比例

### 3.数据质控

scobj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(scobj, pattern = "^MT-")
#上面的函数进行的操作 [email protected]$percent.mt <- PercentageFeatureSet(scobj, pattern = "^MT-")
### 该操作会在metadata数据里面增加一列叫做percent.mt


### 质控数据可视化，使用VlnPlot函数
VlnPlot(scobj, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)


### 正式筛选，筛选的是细胞，最终细胞减少
# 根据具体情况进行筛选阈值的确定
scobj <- subset(scobj, subset = nFeature_RNA > 500 & nFeature_RNA < 6000 & percent.mt < 10)
scobj <- NormalizeData(scobj)
scobj <- FindVariableFeatures(scobj, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
scobj <- ScaleData(scobj, features = rownames(scobj))
scobj <- RunPCA(scobj, features = VariableFeatures(object = scobj),reduction.name = "pca")
ElbowPlot(scobj)

DimPlot(scobj, reduction = "pca")

### 不进行批次矫正
scobj <- RunUMAP(scobj,reduction = "pca", dims = 1:10, reduction.name = "umap_naive")
p1 <- DimPlot(scobj, reduction = "umap_naive",group.by = "orig.ident")

这里降维分析过程中，RunUMAP函数输入的是PCA数据，输出是在reduction中按照所命名的名字进行，也就是reduction.name这个参数

这里再将展示主成分解释方差的内容进行具体化

## 查看数据的复杂程度
ElbowPlot(scobj, reduction = "pca", ndims = 30)
xx <- cumsum(scobj[["pca"]]@stdev^2)
xx <- xx / max(xx)
which(xx > 0.9) # 可以查看多少PCs解释了90%的方差，假设10%的方差来自于噪声，然后就可以选择相应的PCs
ndim = 33 # dims的参数

去批次后数据分析

library(harmony)
scobj <- RunHarmony(scobj,reduction = "pca",group.by.vars = "orig.ident",reduction.save = "harmony")
scobj <- RunUMAP(scobj, reduction = "harmony", dims = 1:30,reduction.name = "umap")

把去批次后的进行样本降维展示

p2 <- DimPlot(scobj, reduction = "umap",group.by = "orig.ident", label = T)

可以看出去批次之前，研究项目之间的批次效应是比较明显的，即便是类似的疾病样本，其分开的还是十分明显，去批次后，虽然图看起来没有那么漂亮，但是其说明相似的细胞是聚在一起的。

后续分析

scobj <- FindNeighbors(scobj, reduction = "harmony", dims = 1:30)
### 设置多个resolution选择合适的resolution
scobj <- FindClusters(scobj, resolution = seq(0.2,1.2,0.1))

参考文章

单细胞测序流程（一）简介与数据下载

Integration of datasets using Harmony

https://github.com/immunogenomics/harmony

Detailed Walkthrough of Harmony Algorithm

单细胞转录组高级分析：多样本合并与批次校正