【Acta Neuropathol ，IF=14.25】 揭开重症肌无力疾病面纱—如何通过单细胞蛋白组发现潜在免疫治疗靶点

✎ 文章导读 

文章导读：Single-cell profiling of myastheniagravis identifies a pathogenic T cell signature

发表期刊/影响因子：Acta Neuropathol /2021-03/14.251

研究样本：外周血、胸腺组织

研究内容：1）CyTOF挖掘确定MG致病关键细胞亚群，且与疾病严重程度相关；2）大规模研究验证，该信号可作为监测疾病严重程度和指导MG患者临床治疗的生物标志物；

重症肌无力（MG）是一种由于靶向乙酰胆碱受体的自身受体导致的神经肌肉信号受损而引起的自身免疫性疾病，其自身抗体水平与疾病严重程度无关。但目前对于驱动MG的细胞和分子机制仍不清楚，缺乏对MG患者胸腺和周围免疫细胞参与的全面系统的研究。基于此，研究人员利用质谱流式细胞技术（CyTOF）对MG患者的血液和胸腺样本进行了分析以揭示其免疫失调。

MG患者外周血免疫组成

首先研究人员对MG患者和健康人的外周血免疫组成进行分析，研究人员在单细胞分辨率下对外周血的谱系、活化标记以及分泌的13种细胞因子进行分析（Fig 1. a-b）。研究发现MG患者和健康人间的外周血的免疫组成具有相似性，免疫细胞表达间无显著频率差异(Fig 1. c-d)，这些结果表明 MG 的致病变化要么是通过系统免疫功能紊乱，要么是通过改变局部受限的免疫区域，如胸腺。

Fig.1 MG患者和健康对照组的外周血免疫组成差异

系统性产生TNF的CD103+ Th细胞是疾病特征性亚群，且与临床疾病进展负相关

对T细胞产生的细胞因子进行功能研究，研究发现MG患者的粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）的表达低于健康对照组，且绝大多数分泌的GM-CSF来源于 TEM 细胞亚群。 此外，较之低活动性MG，高活动性MG 患者的GM-CSF占比更低(Fig 2. c)。这些结果表明MG患者CD4+TEM 表达 GM-CSF明显失调。随后，研究人员根据CD4+ TEM分泌细胞因子表达以分析与疾病相关的细胞因子模式的细胞亚群。研究人员鉴定了13组产生细胞因子的细胞，其中3组与疾病严重程度显著相关，2组与疾病本身相关。这5个细胞亚群都能够表达GM-CSF、TNF以及IL-2 (Fig 2. d)。这些数据表明，尽管MG具有炎症原性，TEM患者的外周血中GM-CSF的表达降低是普遍存在的，而不是特定的细胞因子免疫图谱。

此外，基于Th细胞转运相关分析表达，研究人员发现了两个具有不同表型的记忆性Th细胞，主要表现为特异性表达CXCR5的TFH及表达CD103的ThCD103亚群（Fig 2.e）。较之其他亚群，ThCD103细胞高表达GM-CSF-，TNF-，IL17A-，IL-22-，IL-21-，IL-13-和IL-10-（Fig 2.e-f）。此外研究发现，这种高炎性不成熟的亚群可能具有多种功能特性和显著的转运能力。进一步研究MG常规诊断的标志物抗AChR自身抗体滴度与疾病严重程度无关, 而表达TNF的THCD103细胞频率与临床疾病严重程度之间存在显著的负相关（Fig 2.g）。

总之，尽管MG患者血液中的整体免疫成分与健康人没有差异，但研究观察到MG患者某些巡逻T亚群的频率较低，例如表达GM-CSF的ThGM和ThCD103细胞。在高活动性MG患者中，炎症信号的收缩尤其明显，这与我们目前对MG炎症过程的理解相反。

Fig2.系统性产生TNF的TH CD103细胞亚群是MG疾病特征性细胞亚群

MG患者胸腺中浸润大量Th细胞和B细胞

前面的研究发现外周血中ThCD103 细胞与MG疾病严重程度相关，那是不是胸腺中也存在这样的现象呢？研究人员通过将CyTOF获取的PBMC数据同光谱流式获取的胸腺数据进行比对，研究发现了胸腺中的发育的细胞亚群。此外，同对照组相比，MG胸腺的B细胞、NK细胞、Th细胞表达占比较高，但细胞毒性CD8+细胞频率不高（Fig 3. a-b）。对B细胞进行进一步分群研究发现，同对照组相比，MG中类转换IgG+和IgE+/IgA+记忆B细胞显著增加（Fig 3.c-d）。此外，与MG患者的外周血相比，MG胸腺含有相对更多的记忆B细胞，进一步证明了MG患者自身免疫的一个明确的局部炎症过程（Fig 3.d）。

Fig 3.MG患者胸腺中浸润大量Th细胞和B细胞

MG患者胸腺髓质区域浸润ThCD103和ThGM细胞

根据类别转化记忆B细胞的显著浸润，研究人员发现MG患者的总TFH细胞和表达IL-21的TFH细胞频率增加（Fig 4.a-b）。作为MG免疫响应中特异性收缩的细胞亚群，MG患者的增生性胸腺区域也发现ThGM细胞(Fig 4. d)。为了进一步验证胸腺高度炎症性组织驻留ThCD103细胞可以重新进入循环并产生外周中Th CD103细胞的观点，研究人员对胸腺和血液中ThCD103细胞、TFH细胞和Th细胞进行了详细的表型比较。研究发现，胸腺ThCD103细胞表达CD69(外周血不表达)，但外周血ThCD103表达迁移相关感应分子CCR4/ CCL17/CCL22.。有趣的是，胸腺ThCD103细胞与TFH细胞具有相同的特征，例如PD-1高表达和IL-21分泌(Fig 4. e)。多重免疫荧光同样发现ThCD103细胞在MG胸腺富含B细胞的髓质区域富集（Fig 4. f)。与MG患者体内产生TNF的ThCD103+细胞收缩，这些研究发现支持组织驻留Th细胞在MG局部驱动的B细胞病理中的致病作用。

全身性免疫ThCD103和ThGM细胞的特异性收缩以及MG患者炎症胸腺中特征性细胞的扩张，表明这些细胞在发炎的胸腺中具有致病性的局部滞留，而不是全身免疫失调。为了检验这一假设，研究人员分析了治疗性胸腺切除术后血液中识别出的特征亚群的频率。研究发现胸腺不全患者中的ThCD103和ThGM炎症特征明显扩大，且ThCD103细胞产生的高水平胸腺组织再生细胞因子IL-22在既往接受胸腺切除术的MG患者中明显减少(Fig 4. g)。最后，研究人员研究发现与免疫抑制一致，MG免疫治疗（硫唑嘌呤治疗）患者血液中ThCD103细胞的相对频率显著降低(Fig 4. h)。该研究结果与接受硫唑嘌呤治疗的患者复发性病毒感染和病毒引起的恶性肿瘤风险增加有关，从而突出显示了对更具体的治疗干预措施的需求。

Fig 4. 特征性Th细胞在MG胸腺的髓质区域富集，在胸腺切除术后血液中反弹

文章总结

在该研究中，研究人员通过MG全面免疫图谱的建立，确定了炎症循环记忆辅助T细胞（Th）的两个细胞亚群，这些标志性ThCD103和ThGM细胞在病变胸腺中富集，并与疾病的严重程度呈现负相关关系。此外，研究发现，MG患者手术切除胸腺后，血液中两种标志性Th亚群均出现反弹，表明它们是疾病活动的细胞标志物。此外，经多中心大规模研究验证，该信号可作为监测疾病严重程度和指导MG患者临床治疗的生物标志物。该研究对MG免疫景观的深入分析提供了对疾病发病机制的有价值的见解，提出了新的生物标志物，并确定了新的潜在治疗靶点。

【参考文献】

Ingelfinger, et al.，Single-cell profiling of myasthenia gravis identifies a pathogenic T cell signature. Acta neuropathologica,  2021.