丝状真菌基因组DNA提取 ---- HP Fungal DNA Kit

一、核酸

核酸本质上是由3'，5'-磷酸二酯键连接的dNTP多聚核苷酸长链组成。根据核苷酸的不同核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。核酸提取过程中经常涉及到的操作是基因组DNA和总RNA的提取。
DNA易溶于水，不溶于苯酚、乙醇、异丙醇、氯仿等有机溶剂。

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DNA提取总的原则是：
① 提取过程中防止和抑制细胞中DNase对DNA 降解；
② 保证核酸一级结构的完整性；
③ 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；
④ 尽量去除蛋白质、糖、脂等其他大分子的污染；
⑤ 去除其他核酸分子如RNA的污染

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二、HP Fungal DNA Kit — HP真菌DNA提取试剂盒

该试剂盒采用CTAB法和硅胶柱相结合的纯化方式，适用于从富含多糖类、酚类或DNA含量低的新鲜或干燥的真菌中提取高纯度的基因组DNA。新鲜或干燥的真菌组织研磨后，经CTAB裂解液裂解，氯仿抽提去除多聚糖和其他影响下游应用的各种杂质，调节结合条件，转移至HiBind柱子中离心吸附DNA，两次快速洗涤去除残留的多糖类等杂质，最后用低盐缓冲液洗脱DNA。

十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl-ammoniumbromide,CTAB）是一种阳离子去污剂，能溶解细胞膜，并具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，与核酸结合，使核酸便于分离。

图片来自TSINGKE.png

试剂盒组分.png

二、实验前期准备：

β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、液氮、研钵、10/2/1.5mL离心管、液氮神器、65℃水浴锅、涡旋振荡器、65℃ddH₂O

三、注意事项

注意事项.png

五、Steps：

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⒈于液氮中充分研磨新鲜菌丝，转移至2mL离心管中，加入500μLCPL Buffer 和10μLβ-巯基乙醇，涡旋混匀，裂解样品；
⒉在65℃水浴锅孵育15min，在孵育期间取出离心管混匀2次；
⒊加入500μL氯仿：异戊醇（24:1）混合液，涡旋混匀，≥10000g离心5min；
⒋转移300μL上清液到新的1.5离心管中；
⒌加入150CXD和300μL无水乙醇调节结合条件，涡旋混匀；
⒍转移上述混合液到HiBind DNA Column 中，10000g离心1min；
⒎加入650μLSPW Wash Buffer，10000g离心1min，弃滤液；
⒏重复步骤7；
⒐空甩2min；
⒑200μLddH₂O洗脱两遍。

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思考
Q1：氯仿的作用？
A1：加大比重，使得有机相始终在下层，方便水相的回收
Q2：异戊醇的作用？
A2：异戊醇的作用主要是让离心后上下层的界面更加清晰，也方便水相的回收

流程.png

分层.jpg

四、纯度检测

图片来自TIANGEN.png

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