【文献分享】第一个水稻稻瘟病基因图谱绘制

写在前面
        这是第一篇系统讲述稻瘟病的文献，包括它的基因组、生活史、侵染变化以及对应植物的防卫反应，引用量高达到1030次，基本上发表和稻瘟病相关的文章都会引用这篇文献，就像做植物免疫的都会引用zig-zag model一样。这段时间的话，会不定期更新一些稻瘟病中的一些经典文献或最新突破，特别是效应蛋白相关的，希望跟大家一起共同学习。
附文献信息：The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea

1.基因组的获取

        采用鸟枪法测序获取稻瘟病菌 70-15的基因组信息，最终得到的基因组大小是38.8Mb。根据端粒的重复基序(TTAGGG)n得到染色体末端。

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2.基因组信息

        在拿到基因草图后，基因的功能是我们最关系的。因此注释基因也就变成了第二个要务。预测得到11109个基因，其中10082个基因在红面包菌(稻瘟病的近缘种)中发现，并且红面包菌中有个称为重复诱导的点突变过程(repeat-induced point mutation,RIP)。这种现象在减数分裂的过程中会消除重复基因，因此限制了红面包菌的旁系基因复制的能力，因此限制了此基因家族的扩张。而在稻瘟病基因组种，与致病性相关的几个基因家族得到了扩张。

3.稻瘟病中的GPCR家族

        G-protein-coupled receptors with seven transmembrane helices(GPCRs)通过G蛋白的异源三聚体的形式来传导环境信号来激活次级信号分子，从而调节基因表达。稻瘟病菌基因组中包含约61个没有被报道的GPCR类的基因，其中的12个能形成一个亚家族。这12个基因在N端包含CFEM结构域(conserved fungal-specific extracellular membrane-spanning domain)，与人GPCR的EGF(epidermal growth factor)模块相似。其中一个CFEM-GPCRs的基因，Pth11，参与附着胞的形成和致病性。GPCR类的基因在非子囊菌中，如酵母，玉米黑粉菌中，是完全缺失的。

4.稻瘟病菌中与致病性相关的信号途径

        稻瘟病菌中有三个MAPK cascades来调节附着胞的发育、侵染钉的形成及高渗透压的改变，其中两个MAPK cascades来控制毒性基因相关的表达。核心的是Pmk1 MAPK通路，参与交配和和致病力的形成。
        cAMP信号对于诱导附着胞的形成和膨压驱动的侵染是必需的，但是目前对于它的信号途径解析还不是很清楚。Pth11 GPCR在cAMP信号的上游，揭示了CFEM-GPCR家族可能在这个途径中发挥了未知的功能。

5.膨压驱动的侵染

        稻瘟病菌的附着胞可以通过积累高达3M浓度的甘油，产生巨大的膨压以突破植物角质层。发芽的孢子具有相当多的通用性，能够从贮藏产物中在附着胞合成甘油。稻瘟病菌在线粒体中β-氧化支链脂肪酸，也能利用糖酵解的中间产物来合成甘油。因此灵活地发生脂代谢中和从糖酵解中转移中间产物的能力也许对于稻瘟病在附着胞发育过程中进行快速的甘油累积是重要的。

5.1稻瘟病菌的生活史

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        稻瘟病菌的生活史可以分为无性繁殖和有两个过程 如上图。无性生殖过程中在分孢子梗末端产由三细胞组成的鸭梨型 无性生殖过程中在分孢子梗末端产由三细胞组成的鸭梨型分生孢子 ，一个分生梗上可以产多孢子 ，一个分生梗上可以产多个分生孢子。此外，有报道称稻瘟病菌无性 。此外，有报道称稻瘟病菌无性 。此外，有报道称稻瘟病菌无性繁殖阶段不仅产生鸭梨型大孢子（Macroconidia，MA），还可以产生一种较小的新月形小孢子 （Microconidia，MI），这种分生孢子同样具有致病力。此外，两种不同交配型的生理小种相互结合形成子囊壳进行有性生殖。稻瘟病菌主要通过无性繁殖阶段产生的分孢子侵染水稻， 可以侵染水稻的各时期，包括叶、茎节点和花序 。
        为了能侵染寄主叶片，首先分生孢子通过水合作用从孢子的顶端产一种黏液，这种黏液可以将孢子锚定在叶片包裹蜡质层的疏水表面，随之孢子萌发产生芽管 。当芽管感知到适合的表面环境以后，芽管顶端会分化形成一个圆屋顶状的侵染结构，称为附着胞。附着胞形成了以后，为了侵入寄主细胞，附着胞会在细胞内累积甘油，产生庞大的膨压从而穿透细胞壁。附着胞的细胞壁内壁上会堆积形成密集的黑色素层，黑色素的存在会阻挡甘油从细胞内流出，但是对于水的进出没有阻碍，因此可以确保附着胞快速的吸收水分从而产生巨大膨压高达8.0MPa。当膨压达到临界值以后，细胞骨架结构会发生重组，形成侵染钉，侵染钉会穿透寄主细胞壁，侵入第一个寄主细胞内。成功侵入以后，染钉分化形成最初的菌丝（Invasive hyphae，IH），在活细胞内继续生长延伸。植物细胞膜包裹在侵入菌丝周围，形成被称为 extra-invasive huphal membrane（EIHM）的结构,这是一个在水稻细胞膜与侵入菌丝间的类似原生质体的封闭结构。
        随着最初的侵入菌丝发育，在其顶端会形成一个称为biotrophic interfacial complex（BIC）的结构。当侵入菌丝分化形成球根状菌丝以后，BIC就处在了球根状菌丝的位置 。当菌丝扩展到第二个细胞时，会在第二个侵入寄主细胞的菌丝顶端形成新BIC结构。在侵染过程中的活体营养阶段， 稻瘟病菌会分泌一系列效应因子到水稻细胞内，用来抑制水稻的免疫反应，操控寄主细胞生理机能，以使菌丝更好增殖扩散。效应因子不只会被分泌到已经侵染的寄主细胞内，还会经由寄主胞间连丝扩散到隔壁细胞去，为菌丝的扩散提前营造合适的环境。截至目前为止，已经鉴别到了许多稻瘟病菌效应蛋白，虽然其中部分的具体功能尚未明确。但有几点相同的地方，效应蛋白一般都较小，大多数只有 100~200个氨基酸，一般不具有明确的结构域，相互之间也不具有相似性。因此预测效应蛋白在寄主细胞内发挥的功能还是具有一定的难度。

6.稻瘟病拥有一个复杂的分泌蛋白组

        稻瘟病中预测有739个分泌蛋白，是红色面包菌的两倍还多。有些分泌蛋白预测编码降解植物细胞壁的和角质的酶。例如，稻瘟病菌中的八个基因编码角质酶-甲基酯酶，来降解叶角质层的角质。这些基因中的几个在侵染过程中显著上调，

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时间点的选择：
侵染的7h是极性生长的终止和顶端弯钩的出现；
侵染的12h是顶端的肿胀和黑化作用的开始。
        在这些分泌蛋白中，有些展示出结合碳水化合物的结构域。番茄叶霉菌的效应蛋白Avr4 能够结合几丁质，因此保护了真菌细胞壁免受来自植物的几丁质酶的水解。分析它的蛋白质序列发现其有一个半胱氨酸pattern(CX₇ CCX₅C)，并且这种pattern在稻瘟病菌中是高度丰富的。该基序可能代表了一种不同的几丁质结合基序，其丰度可用于诊断与植物相关的丝状子囊菌。

7.真菌的效应蛋白和PAMPs

        已知植物病原微生物直接分泌蛋白质进入宿主植物细胞，扰乱宿主细胞信号或抑制植物固有免疫系统。反过来，植物适应性免疫系统已经进化到能够识别病原体效应蛋白
(常被称为病原体相关分子模式，PAMPs)。在稻瘟病菌和水稻的互作过程中，这种免疫取决于gene for gene系统(一个宿主的抗性基因对应单个病原菌的效应蛋白)。
        分析基因组发现，效应蛋白可分为三类，一是假定分泌的；二是富含半胱氨酸的多肽；三是NPP1类(necrosis-inducing peptide of Phytophthora infestans)。
富含半胱氨酸的多肽通常认为是PAMPs，在番茄和叶霉病的互作中得到阐明。70-15中包含4个已知的稻瘟病无毒基因:AVR-Pita,ACE1,PWL2和PWL3。但是没有发现稻瘟病菌中PWL1, PWL4 or AVR1-CO39的直系同源基因；与此类似的还有来自番茄叶霉病的Avr2, Avr4, Avr9, ECP2, ECP3 and ECP5。这突出了目前鉴定的真菌无毒基因的多样性和缺乏序列相似性和保守性。

8.稻瘟病菌中的次级代谢途径

        丝状真菌是众所周知的次生代谢物的制造者，在自然界中，这些代谢物发挥各种各样的功能，可能使生态位开发成为可能。稻瘟病基因组中有23个基因编码聚酮合酶，其中的3个在侵染过程中上调表达。这23个聚酮合酶中大多数在基因簇中出现，并且其临近的基因被预测编码细胞色素P450和单加氧酶，这就能够修饰或定制聚酮主链以形成功能次级代谢物。

9.重复DNA和重复诱导的点突变

        稻瘟菌表现出高度的遗传变异，如果稻瘟病菌在水稻种植过程中出现了新的致病变异，那么就能够侵染以前具有抗性的寄主植物。这种获得毒性通常与转座子介导的失活和PAMP编码基因的删除有关，PAMP编码的基因产物通常能够激活植物的适应性免疫。
        考虑到重复成分的普遍存在以及它们参与重组的能力，一个有机体能够忍受如此巨大的基因组变化或许令人惊讶。然而，在自然界中，水稻的致病菌株稻瘟菌是无性繁殖的，因此，基因组的组织很少(如果有的话)受到减数分裂重组的潜在灾难性影响，这些减数分裂重组涉及结构完全不同的同源染色体。因此，在正常情况下减数分裂产生的重排会被清除，并且重排似乎在没有对营养健康产生有害影响的情况下得以保持。一些重排有望带来积极的影响，特别是那些导致基因丢失的重排，这些基因的产物通常会触发潜在宿主的防御反应。稻瘟病菌中一些宿主特异的基因通常位于基因组转座子丰富的区域，重排为基因丢失提供了丰富的机会。
参考文献：
https://www.nature.com/articles/nature03449