RNA-seq，Ribo-seq数据分析（上）

文献：The Tomato Translational Landscape Revealed by Transcriptome Assembly and Ribosome Profifiling

根据文献，从GEO数据库下载原始测序文件，RNA-seq双端100bp，Ribo-seq单端50bp，两种方式各三个生物学重复。

原始文件

module load sratoolkit/2.9.6

prefetch --option-file SRR_Acc_List.txt

#下载原始测序数据，ncbi，GSE124962，路径~/ncbi/public/sra/

for i in SRR*；do

fastq-dump --split-3 $i #RNAseq的目录下，RNA双端reads转fq

gzip $i

done

for i in SRR*；do

fastq-dump $i #Riboseq的目录下，ribo单端reads转fq

gzip $i

done

The adaptor sequence AGATCGGAAGAGCACACGTCT was fifirst removed from the Ribo-seq data using FASTX_clipper v0.0.14.文献中去adapter的说明，我用cutadapter。

for i in *fastq.gz;do

out=${i%.fastq.gz}_trim.fastq.gz

"cutadapt -a \"AGATCGGAAGAGCACACGTCT\" -O 5 -o ${out} ${i}"

现在Ribo-seq得到SRR8434774_trim.fastq.gz，SRR8434775_trim.fastq.gz，SRR8434776_trim.fastq.gz，三个文件。

作者用番茄SL2.5的参考基因组和ITAG2.4去掉了测序中的rRNA，tRNA，snRNA等等，用SL3参考基因组ITAG3.2版本注释去出数据中基因组重复序列。将SL2.5和ITAG2.4中对ncRNA的注释下载下来，根据注释提取序列，并且建bowtie2索引。

bedtools getfasta -fi S_lycopersicum_chromosomes.2.50.fa \

-bed ITAG2.4_infernal.gff3 -fo internal.fa

module load Bowtie2/2.4.1

bowtie2-build internal.fa internal

#将ncRNA的序列提取出来，internal.fa,并且建比对索引

将RNA数据比对到ncRNA的序列上，利用samtools将未必对上的提取出来，再用bedtools将bam文件转化成双端fq文件。

for id in *_1.fastq.gz;

do

name=${id%_1.fastq.gz}

one=${name}_1.fastq.gz

two=${name}_2.fastq.gz

out=${name}.sam

bowtie2 -x /public/home/yliang/ly/protocol/tommato-ribo/\

ref/SL2.5/internal -p 10 -1 ./$one -2 ./$two  -S ./$out

done

#RNA-seq数据批量比对到small RNA上

module load SAMtools/1.9

for i in *sam;do

out=${i%.sam}.sort.bam

samtools view -@ 10 -bS -f 4 ${i}|\

samtools sort -@ 10 -m 32G -n -o ${out}

done

#将未必对上的read取出来，并且将bam文件排序。

#samtools -f 4指输出没比对上的reads

#samtools sort中默认按照参考gtf文件中的顺序排序，-n加上按照fastq文件的顺序

#ribo和rna的数据这一步都一样

#对于RNA的数据，将bam转化为双端fq，并压缩

module load BEDTools/2.27

for i in *sort.bam;do

fq1=${i%.sort.bam}_sort1.fq

fq2=${i%.sort.bam}_sort2.fq

bamToFastq -i ${i} -fq ${fq1} -fq2 ${fq2}

done

gzip *fq

撒币了，bowtie2有专门输出没比对上的参数，绕了个大圈。对于单端的Riboseq的reads有：

for id in *trim.fastq.gz;

do

name=${id%.fastq.gz}

out=${name}.sam

un=${name}.fq.gz

bowtie2 -x ~/ref/SL2.5/internal -p 10 \

-U ./$id -S ./$out --un-gz ./$un

done

对于双端的RNA-seq数据，有：

module load Bowtie2/2.4.1

for id in *_1.fastq.gz;

do

name=${id%_1.fastq.gz}

one=${name}_1.fastq.gz

two=${name}_2.fastq.gz

out=${name}.sam

un=${name}.fq

bowtie2 -x ~/ref/SL2.5/internal -p 10 \

-1 ./$one -2 ./$two -S ./$out --un-conc ./$un

done

以上步骤去掉了注释的rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA。

下一步是去除包含基因组中包含重复序列的reads，下载SL3参考基因组和ITAG3.2对重复序列的注释文件，将重复序列提取出来，建比对索引。

bedtools getfasta -fi S_lycopersicum_chromosomes.3.00.fa \

-bed ITAG3.2_REPET_repeats_agressive.gff -fo repeat.fa

bowtie2-build repeat.fa repeat

与以上相同的方式，通过bowtie2的--un，--un-conc参数把单端Ribo-seq和双端RNA-seq中未必对上的reads给取出来。OK，过滤完毕。