简介
CIBERSORT这款软件利用反卷积的方法，利用单细胞RNA-seq的数据，提取特征后，反推Bulk-seq各类细胞成分所占比例。这款软件目前推出了CIBERSORTx，但是账号貌似有点难申请
而这次我们着重介绍下CIBERSORT的R版本
而CIBERSORT计算细胞组分的方法使用去卷积原理实现的，而且通常是线性去卷积
如图所示，Bulk-seq表达矩阵的结果可以利用单细胞表达矩阵的结果乘一个权重向量来表示，那么这个权重向量表示的意义即为在Bulk-seq，每一个sample的细胞组分含量
比方说，在这里的cell_1和cell_2可以认为是两种不同的cell type，那么i = 1；j = 2表示的意思是在Bulk-seq中，sample_1中有1份的cell_1和2份的cell_2
R
核心代码由三部分组成：CoreAlg，doPerm，CIBERSORT，其中该软件利用的是svm反卷积进行推算：
#读取文件
X <- read.table(sig_matrix,header=T,sep="\t",row.names=1,check.names=F)
Y <- read.table(mixture_file, header=T, sep="\t", row.names=1,check.names=F)
X <- data.matrix(X)
Y <- data.matrix(Y)
#order
X <- X[order(rownames(X)),]
Y <- Y[order(rownames(Y)),]
其中mixture_file是RNA-seq的数据；sig_matrix为单细胞RNA-seq数据
紧接着对两个文件的基因取交集并且分别标准化：
#intersect genes
Xgns <- row.names(X)
Ygns <- row.names(Y)
YintX <- Ygns %in% Xgns
Y <- Y[YintX,]
XintY <- Xgns %in% row.names(Y)
X <- X[XintY,]
#standardize sig matrix
X <- (X - mean(X)) / sd(as.vector(X))
#standardize mixture
y <- Y[,itor]
y <- (y - mean(y)) / sd(y)
#这里的itor遍历的是mixture_file的列元素，即y是mixture_file的列元素
注意：这里的 itor 遍历的是mixture_file的列元素，即y是mixture_file的列元素，表示的是Bulk-seq的每一个sample，而x代表单细胞数据
接下来就是整个代码的核心段了，涉及到CoreAlg：
#try different values of nu
svn_itor <- 3
res <- function(i){
if(i==1){nus <- 0.25}
if(i==2){nus <- 0.5}
if(i==3){nus <- 0.75}
model<-svm(X,y,type="nu-regression",kernel="linear",nu=nus,scale=F)
model
}
#输出结果
out <- mclapply(1:svn_itor, res, mc.cores=1)
##svn_itor遍历不同的nu
关于参数type:
1.If you have a classification problem, i.e., discrete label to predict, you can use C-classification and nu-classification.
2.If you have a regression problem, i.e., continuous number to predict, you can use eps-regression and nu-regression.
3.If you only have one class of the data, i.e., normal behavior, and want to detect outliers. one-classification.
这一部分res()函数通过调用svm()函数，并调试不同的nu值建立不同的模型（这里 nu 值为1-3），而对于整个svm的过程可以理解为回归问题（SVR，即y为响应变量；X为决策变量，每种细胞类型相当于每一维的数据）
这里简单介绍下SVR（支持向量机回归）：
SVM是用作分类模型，而SVR用作的是回归模型；SVM主要是找到一个超平面能够将数据分类，而SVR寻找的是一个线性模型y=wx+b，目的是使真实值与预测值差距达到最小，从而构建出回归模型，来描述数据的趋势
接下来需要将out的结果（里面囊括3个svm模型）循环赋值出来，并且定义相关的权重：
#do cibersort
t <- 1
while(t <= svn_itor) {
weights = t(out[[t]]$coefs) %*% out[[t]]$SV
weights[which(weights<0)]<-0
w<-weights/sum(weights)
u <- sweep(X,MARGIN=2,w,'*')
k <- apply(u, 1, sum)
nusvm[t] <- sqrt((mean((k - y)^2)))
corrv[t] <- cor(k, y)
t <- t + 1
}
##svn_itor遍历不同的nu
这里的 t 代表不同参数（nu，一共3个值）下的svm模型
这里的权重（weight）定义为：svm的coefs与SV的乘积（svm模型$一下可以找到这个两个系数），这个乘积表示为线性回归平面的法向量（权重）weight，并且权重weight小于0的都定义为0；w代表的是权重矩阵的每一个元素除以该矩阵元素的总和 ；这里的u为X矩阵（单细胞表达谱）的每一个元素减去w；定义k为u矩阵每一行求和；定义
nusvm为 sqrt((mean((k - y)^2)))；定义corrv为 corrv[t] <- cor(k, y)，即k和y的相关系数
注明：
svm的coefs指的是svm模型的系数；而SV指的是支持向量，支持向量是数据集的点，它们靠近分隔类别的平面
这里的coefs指的是svm模型的系数
这里的SV指的是每一种细胞类型对应于每个基因的支持向量，
而这里的coefs与SV相乘目的是构造出细胞组分的数值，这个数值是线性回归平面的法向量 w（如下图），并且svm模型的系数长度与支持向量的长度是一致的，这个法向量的大小代表着分类指标的贡献
那么怎么理解这个贡献呢？
那么对应的决策变量W越高，那么它对响应变量的贡献（指的是增长贡献）越大
举个例子：
- 其中，在bulk的表达矩阵中，gene1 的表达量
E1 = β1×e1 + β2×e4，其中 e1 和 e2 分别是 cell cluster A 和 cell cluster B gene1 的表达量，同理可知其他基因的，也就是 bulk 中 gene1 的表达量由 cell cluster A 和 cell cluster B gene1 的表达量组成，而系数 β1 和 β2 理解为细胞比例- 从图像来看，假设 gene 多的话，单独分离开 cell cluster A 和 cell cluster B来看：
图中的红点代表不同基因的表达量，由于响应变量代表基因在bulk中的表达量，因此纵坐标在 cell cluster A 和 cell cluster B 是一样的。显然在 cell cluster A 中的基因表达量要偏低一些，而在 cell cluster B 中表达量偏高一些；因此基因表达量偏高的细胞，其比例会偏少，因此基因表达量偏低的细胞，其比例会偏多（斜率 β1 > β2； α > θ） 注明E1 = β1×e1 + β2×e4，bulk的表达量由对应 cell cluster A 和 cell cluster B 的基因表达量组成- 这种比例应该理解为SVR多元回归中拟合出来的情况，只不过借助线性方程
E_bulk = β1×e_cell_A + β2×e_cell_B的加和状态，将参数β1和β2比作为细胞比例（细胞的量）乘相应的cell cluster对应基因的表达量，作为最终bulk的基因表达量
然后从 out 中选择最优模型：
#pick best model
rmses <- nusvm
##令rmses 等于 nusvm
mn <- which.min(rmses)
##选择最小值
model <- out[[mn]]
##提取最优模型
#get and normalize coefficients
q <- t(model$coefs) %*% model$SV
q[which(q<0)]<-0
w <- (q/sum(q))
##标准化
mix_rmse <- rmses[mn]
mix_r <- corrv[mn]
#提取最优模型的rmses(nusvm)和corrv
那么经过CoreAlg计算出来的结果为：
result = CoreAlg(X, y)
那么相应的w，mix_r和mix_rmse为：
w <- result$w
mix_r <- result$mix_r
mix_rmse <- result$mix_rmse
其中w为：
每一个w表示其中一个sample各个细胞的组分，即表示bulk-seq在每一个sample中各个细胞组分的占比
而mix_r 和mix_rmse为：
然而，这只是mixture_file(Bulk-seq)的一列数据，接下来我们计算每一列的rmses(nusvm)和corrv
while(itor <= mixtures){
y <- Y[,itor]
#standardize mixture
y <- (y - mean(y)) / sd(y)
#run SVR core algorithm
result <- CoreAlg(X, y)
#get results
w <- result$w
mix_r <- result$mix_r
mix_rmse <- result$mix_rmse
#calculate p-value
if(P > 0) {pval <- 1 - (which.min(abs(nulldist - mix_r)) / length(nulldist))}
#print output
##输出结果列名
out <- c(colnames(Y)[itor],w,pval,mix_r,mix_rmse)
if(itor == 1) {output <- out}
else {output <- rbind(output, out)}
itor <- itor + 1
##这里的itor遍历的是mixture_file的列元素，即y是mixture_file的列元素
}
最后输出的结果为bulk-seq每一个sample的w矩阵：
即每个组分所占比例
小tip
这个官方代码中quantile的标准化方式可能会报错，不妨在CIBERSORT函数下修改如下：
quantile_normalisation <- function(df){
df_rank <- apply(df,2,rank,ties.method="min")
df_sorted <- data.frame(apply(df, 2, sort))
df_mean <- apply(df_sorted, 1, mean)
index_to_mean <- function(my_index, my_mean){
return(my_mean[my_index])
}
df_final <- apply(df_rank, 2, index_to_mean, my_mean=df_mean)
rownames(df_final) <- rownames(df)
return(df_final)
}
##改动如下：
##原：
if(QN == TRUE){
tmpc <- colnames(Y)
tmpr <- rownames(Y)
Y <- normalize.quantiles(Y)
colnames(Y) <- tmpc
rownames(Y) <- tmpr
}
##改：
if(QN == TRUE){
tmpc <- colnames(Y)
tmpr <- rownames(Y)
Y <- quantile_normalisation(Y)
colnames(Y) <- tmpc
rownames(Y) <- tmpr
}
另外，有关p值计算，该软件采用的是置换检验的方式，详见微信文章：《量化免疫浸润时CIBERSORT的注意事项》