肿瘤来源的维甲酸调节瘤内单核细胞的分化以促进免疫抑制
文献概述
研究背景介绍
在肿瘤免疫中，抗原提呈细胞（antigen presenting cells ，APCs)通过捕获肿瘤抗原，对抗原进行加工处理，以抗原肽-MHC复合物的形式提呈给T 细胞使其活化，活化的肿瘤特异性抗原的效应T细胞通过血管迁移并浸润到肿瘤组织中来杀伤肿瘤细胞，从而产生新的抗原再次被APCs捕获，如此循环往复（immunity，2013；39, 1–10）。其中，树突状细胞（dendritic cells，DCs）和刺激性肿瘤相关的巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）主要促进T细胞的抗肿瘤功能，而免疫抑制性肿瘤相关的巨噬细胞主要抑制抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤进展。然而，有研究表明肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）能够促进抑制性TAMs的产生而抑制DCs的功能，从而阻碍功能性抗肿瘤T细胞的产生和维持。因此，确定APCs在TME中的分化机制对于开发新的肿瘤免疫治疗方法尤为重要。
巨噬细胞主要是由胚胎前体细胞或循环单核细胞分化而成。DC来源于多能造血干细胞，主要分为髓系DC和淋巴系DC。在髓系DC中，髓样干细胞分化而来的DC称为经典DC（conventional DCs，cDC），而循环单核细胞分化而来的DC成为单核细胞来源的DC（monocyte-derived DCs，moDCs）。DCs作为激发机体抗肿瘤免疫的最重要的APC，能够加工与处理肿瘤相关抗原及肿瘤特异性抗原，激发强大而持久的肿瘤抗原特异性的CD4+及CD8+ T细胞反应。但是moDCs在抗肿瘤过程中作用尚不清楚。在实体瘤中，TME中单核细胞更倾向分化为抑制性TAMs，这种偏倚性还需要进一步研究。
维甲酸(retinoic acid，RA)是由维生素a衍生物视黄醇通过一系列酶催化生成的，其中视黄醇脱氢酶（retinaldehyde dehydrogenases，Raldh）作为RA生成的限速酶能够催化视黄醇变成RA。许多研究表明RA可以诱导肿瘤细胞凋亡，提高癌细胞对化疗药物的敏感性，临床上常用来治疗急性早幼粒细胞白血病。RA也在免疫耐受中发挥重要作用，一些研究认为RA能够促进DC分化，但也有些研究表明RA可以诱导Foxp3+Treg和Arg+的抑炎性巨噬细胞。还有报道称RA能够促进Th1或Th17细胞应答，阻碍髓系来源的抑制性细胞的功能。不同的实验因素导致了这些矛盾的结果。由于TME中细胞组成的复杂性，RA在其中扮演什么角色呢？
宾夕法尼亚大学Malay Haldar课题组在本研究中打破了RA作为抗肿瘤剂这一范式，他们利用肉瘤模型发现TME中的IL-13能够诱导肿瘤细胞产生RA，RA通过抑制促进DC分化的转录因子IRF4的表达使肿瘤内单核细胞向抑制性TAMs分化，从而促进肿瘤发展。
主要发现
- 肿瘤微环境诱导肿瘤细胞产生RA。
- RA使单核细胞向巨噬细胞而不是向DC分化。
- 阻断RA的产生可增强抗肿瘤T细胞免疫力。
- 药理阻断RA信号可以增强抗PD-1疗法的效果。
专家点评
逻辑亮点：作者从肉瘤模型中TAMs比例明显高于DCs这一有趣的现象出发，利用遗传谱系示踪技术发现TME能够促进单核细胞向抑制性TAMs极化；通过TAMs的基因表达谱分析发现，TAMs表达高水平的维甲酸结合蛋白（retinoic acid binding proteins，CRABPs），而TME中确实有大量的RA，并且这些RA主要来源于肿瘤细胞。经过进一步研究发现，RA可以调控瘤内单核细胞的分化方向，使其分化为抑制性TAMs，而抑制其向DCs的分化。当减少RA的产生或者阻断RA-RAR信号轴时，TME中APCs产生更多的免疫刺激性分子，提高了T细胞的抗肿瘤应答和抗PD-1疗法治疗肿瘤的效果。
由于RA常用来预防癌症的复发，这一新的发现打破了RA作为一种抗肿瘤剂的固有认识，也为部分患者用药后效果不佳提供了新的理论解释。本篇研究也进一步为TME中APCs的分化和肿瘤免疫抑制环境的塑造提供了新的见解，为肿瘤免疫治疗提供一个新的临床思路。
可借鉴之处
这篇研究虽然思路比较简单，作者论证的方法却十分巧妙。研究肿瘤微环境中单核细胞的极化方向时，作者用遗传谱系示踪技术标记单核细胞（tdTom）和树突状细胞（GFP），将带有荧光标记的单核细胞分离出来之后回输到荷瘤小鼠体内，从肿瘤中分离出来tdTom阳性的细胞进一步分析其分化方向，有力证明了肿瘤微环境中单核细胞更倾向分化为抑制性TAMs；在证明TME能够诱导肿瘤细胞产生RA时，作者将分泌RA的Aldh+肿瘤细胞和不分泌Aldh-肿瘤细胞从肿瘤中分离出来，发现Aldh+肿瘤细胞体外培养时并不能分泌RA，而将Aldh-肿瘤细胞接种到小鼠身上，发现Aldh-肿瘤细胞也能够分泌RA。最后作者从TCGA数据库中病人的样本中进一步论证了RA和抑制性免疫微环境的相关性，提升了这项研究的临床意义。这些都非常值借鉴。，
进一步研究的问题
RA能够抑制IRF4的表达来抑制单核细胞向DC的分化，那么RA促进TAMs分化的具体机制又是什么呢？是否能够利用这些机制发展出更好的方法来靶向抑制TAMs分化呢？
值得探讨的问题
既然瘤内T细胞分泌的IL-13能够作用于肿瘤细胞，促进RA的产生，而RA又能够促进肿瘤进展，那么作者为什么不使用抗IL-13的抗体看看能否减缓肿瘤进展呢？
图片解析
肿瘤微环境中单核细胞的分化情况？
在肉瘤模型发现TME中，单核细胞（CD45+CD11b+Ly6C+）和TAMs（CD45+CD11b+F4/80+Ly6C-）占据了白细胞的大多数(A)，而DCs（CD45+ZBTB46+）却很少(B)。将这三种细胞分离出来，体外和T细胞共孵育发现，TAMs极大地抑制了T细胞增殖（C，D），而DCs能够促进T细胞增殖（E）。利用谱系示踪技术发现绝大多数单核细胞向TAMs方向分化(F，G，H)。体外分离TME中的单核细胞进行诱导发现这些单核细胞也能分化成DC (I，J)，所以猜测是肿瘤微环境中的某些因素抑制瘤内单核细胞向DCs分化，促进其向TAMs分化。
结论1：TME能够促进单核细胞向抑制性TAMs分化。
哪些因素驱动瘤内单核细胞向TAMs分化呢？
通过分析TAMs的基因表达谱发现，TAMs细胞表达更高的视黄酸结合蛋白（ CRABPs） （A），肿瘤组织也有更高的Raldh表达（B）。然后，用液相色谱/质谱检测肉瘤模型中RA的主要生物活性亚型反式维甲酸（ATRA）含量均高于正常间质组织(C)。进一步研究发现，RA主要来源于肿瘤细胞（D），而且不同的肉瘤类型Raldh的三种亚型表达水平也不一样（E）。但在体外培养时，肿瘤细胞系几乎不表达Raldh，而在肿瘤组织却高表达（F）。所以猜测TME中某些因素导致RA的分泌。为了证实这一猜想，将肿瘤组织中 Aldh+的肿瘤细胞（即表达Raldh的肿瘤细胞）和Aldh-的肿瘤细胞（即不表达Raldh的细胞）分离出来体外培养一段时间（G），发现表达Raldh的肿瘤细胞体外培养时停止了RA的产生（H），当把这两种细胞重新接种到小鼠身上（G），发现体内两种细胞株表达的Aldh并没有差别（I）。那么究竟TME中什么因素诱导Aldh的表达呢？通过测序数据发现表达Aldh的肿瘤细胞表达更高的IL13Rα2 (J)。由于IL13Rα2能够被IL-13信号诱导表达，体外用IL-13刺激肉瘤细胞发现，Raldh 3表达明显升高(K)。当敲除IL13Rα1时，IL-13刺激并不能上调IL13Rα2和Raldh3的表达（L）。移植敲除IL13Rα1的肿瘤细胞株成瘤后也发现肿瘤组织中Raldh3的表达下降（M）。
结论2：TME中IL-13能够诱导肿瘤细胞产生更多的RA。
肿瘤微环境中的RA是怎么影响单核细胞分化的？
体外培养条件下，RA能够抑制单核细胞向DC分化(A,B)，促进单核细胞向TAMs分化(D，E)。使用RAR的激动剂CH55也能够抑制DCs的分化，其拮抗剂BMS493能够抵消RA的作用（C）。RA对肿瘤来源的单核细胞也有同样的作用（F，G）。有趣的是，在RA刺激下，单核细胞来源的APCs和TAMs抑制功能也随之增强（H，I，J）。微阵列基因表达谱分析，RA处理细胞后，和巨噬细胞分化相关的基因表达上调，而和DC分化相关的基因表达下调(K，L)。因为RA能够下调IRF4的表达，之前有研究表明，单核细胞向DCs分化需要IRF4参与，所以RA可能通过抑制IRF4的表达进而抑制单核细胞向DCs分化。通过使用RA的激动剂CH55或抑制剂BMS493，证实了这一猜想（M，N）。与RA刺激野生型小鼠来源的APCs作用类似，当IRF4敲除后，T细胞的增殖也受到抑制（O）。过表达IRF4后，RA抑制DCs分化的作用也随之消失（P）。
结论3：RA在体外能够促进单核细胞向抑制性TAMs分化，抑制其向DCs分化。
RA能够影响DCs的分化，阻断RA分泌或其信号通路对肿瘤浸润的免疫细胞有什么影响？
由于Raldh3敲除后，Raldh1表达水平会代偿性增加，所以作者构建了Raldh1/3双敲除的小鼠（DKO）阻断RA的分泌。与对照组相比，DKO小鼠瘤内TAMs比例明显下降（A），而CD11b+ DC的比例明显上升（B）。在DKO小鼠瘤内相当一部分F4/80+ TAMs表达CD11c和MHCII分子。为了进一步明确RA引起肿瘤内白细胞的变化，用单细胞测序技术比较了DKO荷瘤鼠和正常荷瘤鼠肿瘤浸润的CD45+细胞发现（D），瘤内髓系来源的细胞具有较大差异，DKO小鼠瘤内髓系来源的细胞具有高比例的DCs（E，F）。进一步分析TAM发现，DKO小鼠瘤内TAM表达更少的免疫抑制性分子（TAM1），更多的免疫刺激性分子（TAM2）（F，G）。当DKO荷瘤鼠来源的TAMs和T细胞共孵育发现，TAMs抑制T细胞增殖的能力明显下降（H）。但血液中白细胞和单核细胞的比例并没有明显变化，说明减少肿瘤细胞分泌RA对免疫应答的影响局限于免疫微环境（I）。分析TIL发现，DKO荷瘤鼠TIL中CD4+T细胞比例明显上升(J)，T细胞分泌IFN-γ的能力也明显提高（K)。
结论4：减少肿瘤细胞分泌RA能够增强瘤内刺激性APCs的产生
既然RA能够影响免疫应答，那么减少RA分泌能增强抗肿瘤效果吗？
与对照组相比，DKO荷瘤鼠肿瘤体积明显减小，生存期明显延长(A，B)。当在DKO肿瘤细胞株中过表达Raldh2修复RA的产生时，肿瘤生长恢复对照组水平（C），而且瘤内髓系来源的细胞表达更多的刺激性分子（D）。剔除CD4+或CD8+T细胞后，肿瘤快速生长，也进一步证明了T细胞在这个过程中的作用（E）。在Batf3-/ -小鼠中（cDC1s缺失），DKO肿瘤也迅速增长，证明了RA减少所引起的抗肿瘤效应需要cDC1s的参与（F）。当接种过表达OVA肽段的DKO肿瘤细胞株时，荷瘤鼠脾脏中肿瘤特异性的CD8+ T细胞的比例也明显上升（G）。如果同时给予免疫检查点PD-1阻抗剂则显示出明显的抗肿瘤协同作用(H，I)，并且联合治疗组中完全消退的小鼠能够持续抵抗该细胞株，而对其他肿瘤细胞株没有抵抗作用（J）。当在正常C57小鼠一侧注射DKO肿瘤细胞株一侧注射正常对照肿瘤细胞株时发现，RA分泌的减少也能提高对侧肿瘤对抗PD-l治疗的敏感性（K，L，M）。
结论：减少肿瘤分泌的RA能够提高T细胞的抗肿瘤应答，并且增强抗PD-1疗法的效果。
体内阻断RAR信号对肿瘤免疫应答的影响是否和阻断RA产生的效果一致呢？
当用药物BMS493阻断RA-RAR这个信号轴的时候，荷瘤小鼠瘤内TAMs比例明显降低（A），APCs表达更多的活化型marker（B），T细胞比例也随之提高（C）。有趣的是，在肉瘤模型中BMS493治疗也能提高抗PD1疗法的效果（E），但是由于B16F10不分泌RA，该肿瘤模型中BMS493治疗并没有效果，也不能提高该肿瘤对抗PD-1疗法的应答（F）。在自发肉瘤模型中，BMS493治疗也能提高瘤内刺激性髓系来源的细胞和T细胞的比例，并且TAMs表面倾向于高表达一些免疫刺激性分子（G，H）。BMS493刺激LysMCre：Rosa26tdT小鼠来源的骨髓单核细胞回输到同源的FS肿瘤模型中发现，相比于对照组，肿瘤微环境中回输的单核细胞很大一部分分化成了CD11c+ MHCII+ DCs（I），而且回输BMS493刺激后的单核细胞肿瘤生长明显减慢（J），TME中有更高比例活化型的APCs和杀伤作用的T细胞（K）。
结论6：体内抑制RAR信号能够增加TME中刺激性APCs的数量，并且能够协同抗PD-1抗体治疗肿瘤。
这一发现有什么临床意义？
首先，作者评估临床上肉瘤病人的样本，发现病人的肿瘤组织确实高表达RALDH(A)，而且主要是CD45-的细胞表达（B，C）。当分析TCGA数据库中的肉瘤病人数据发现，RA在一些肉瘤亚型中存在富集，主要包括STLMS、ULMS、SS(D)。在DDLPS、UPS和MFS中RA富集评分更高(E)。在多种肿瘤细胞中，RA的富集评分和RALDH3的表达成正相关，一些TGF-β和IL-10信号通路相关的免疫抑制分子也和RA的富集分数呈现一定的正相关性（F）。
结论：临床中，RA的富集评分与抑制性肿瘤微环境成有一定相关性。
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