外泌体多组学15-尿液外泌体sRNA建库优化-增加切胶回收扩增-比对率20%提升至33%

外泌体，40-130nm的膜衍生囊泡，已被鉴定为细胞间遗传物质交换和通信的新载体，包含各种核酸物种，包括mrna、小的非编码rna(sncRNAs)，特别是miRNAs。

从外泌体中分离出的miRNAs的测序在识别新的疾病生物标志物方面具有很大的潜力，但外泌体的RNA数量较低，阻碍了充分的分析和定量。本文评估了开发一个优化的小RNA(sRNA)文库制备方案的几个步骤，用于来自尿外泌体的下一代测序(NGS)miRNA分析。

难点：

限制因素是外泌体中小RNA(sRNA)的数量低于组织、细胞培养或血浆等生物液体，这使得它难以获得用于NGS分析的优质sRNA文库。

文章信息

文献标题：Optimization of small RNA library preparation protocol from human urinary exosomes
Doi：https://doi.org/10.1186/s12967-020-02298-9
发表时间：J Transl Med (2020) 18:132
通讯作者： Raquel Cortes 心脏代谢和肾脏风险研究小组，美国陆军生物医学研究所

数据：24例来自供体患者的尿外泌体样本，对于Traditional方法和Optimized方法使用的是：所有样品均重复处理，一份不排除PCR产物的大小，另一份使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶纯化以排除PCR产物的大小。

image-20220518183236922.png

凝胶纯化的样品sRNA reads（占总原始序列的33%）高于未纯化的样品（占总原始序列的20%）。

单独看miRNA的reads效果时：纯化样本miRNA 占 33% of the total raw reads，未纯化的样本占19%。

image-20220518174553652.png

为了确定大小选择步骤是否在miRNA检测中产生了任何有意义的变化，我们在优化的工作中比较了有或不凝胶纯化的测序结果。

我们发现了一个类似的标记miRNA群体，有或没有大小选择步骤，经过log2转换后，获得了R2=0.96。

image-20220518203055052.png

我们分析了凝胶纯化对其他非编码RNA(ncRNA)类型的影响效果。与miRNA群体一样，其他ncRNA的分布没有变化，在ncRNA类型之间获得了相似的百分比。

在纯化和未纯化条件下，Y-RNA最具代表性（分别为66%和54%），其次是lncRNA（分别为20%和26%）和tRNA（分别为5%和8%）。

image-20220518180108284.png

小结：