2020-12-03 慢病毒

慢病毒

背景

慢病毒载体

慢病毒载体（lentivirus vector, LV）是一类来源于逆转录病毒的载体，慢病毒之所以是称为慢病毒，是因为感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病。

最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统等。

结构

病毒结构蛋白

gag、pol和env。gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白（p7）、内膜蛋白（p17）和衣壳蛋白（p24）；pol基因编码病毒复制相关的酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。

病毒调节蛋白

rev,tat。rev主要参与蛋白调节的表达水平，tat参与蛋白转录的控制，与病毒的长末端重复序列（long terminal repeats, LTRS）结合后促进病毒的所有基因的转录。

四个辅助蛋白

即vif、vpr、vpu、nef，帮助病毒包装完成

包装组件

[Addgene] https://www.addgene.org/viral-vectors/lentivirus/lenti-guide/ Lentiviral Guide

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慢病毒表达体系

把这些基因都整合到病毒的表达载体质粒上，然后利用质粒表达各部分基因，就可以组装成病毒了！

Q：如何保证包出来的病毒不会有生化危险呢？因为这些可是HIV的病毒体系呀 A：将病毒体系拆分一下，病毒表达体系有2质粒系统，3质粒系统，4质粒系统。 Q：这些质粒系统有什么区别呢？ A：他们的安全系数不一样，2质粒系统和3质粒系统有可能产生有活性的病毒，4质粒系统主要是：pGag/Pol、pRev、pVSV-G，此外，还有一个可以放置目的基因序列的载体。这个体系产生活性病毒的可能被大大降低。(5′端LTR被替换成了CMV，3′端LTR被换成了SV40 ployA 这两个都是可以增强表达，减低病对人体毒危害性)

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pre：一定要用去内毒素的试剂盒去提质粒，如果质粒没有去内毒素的话，会很大的影响转染的效率。可能会导致结果失败！

用的最广的是二代包病毒系统，通常由三个部分组成：

1. Packaging plasmid：比如 psPAX2，其中包括HIV gag, pol, rev, tat

• tat是用来激活transfer plasmid

2. Envelop plasmid: 比如pMD2.G，里面包括VSV-G

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3. Transfer plasmid:两段LTR中间，夹着promoter驱动的cDNA或者shRNA

• 其中5‘LTR需要靠tat的表达才能激活下游

• 对于shRNA来说，用的promoter一般是U6或H1，可以驱动Pol III。

• 对于cDNA来说，用的promoter一般是CMV或者RSV，可以驱动Pol II。

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接下来是三代包病毒系统，它比二代更加安全，效率却没有二代高。

病毒感染的本质:

它的本质是把自己的序列整入宿主的序列。

如果只有transfer plasmid中的序列整入进宿主的话，那么它是无法再次变成病毒的，因为其他packaging和envelop的序列没有被整入。

如果要想让宿主自己产生病毒，需要满足一个很艰难的条件，就是要把transfer，packaging和envelop三个plasmids中的序列同时recombine进入宿主。

三代里把packaging分成了两个部分，一个有Rev，另一个有Gag和Pol。

因此所有plasmid加在一块后，就有四个plasmids了，进而加大了四个同时recombine的难度。

同时，通过修改transfer中的5’LTR使其不再依赖HIV tat来激活下游，三代系统摒弃了packaging里面的tat，因此安全系数进一步提升。

• 这里注意一下，如果你的vector是三代的（即有不需要依赖tat激活的5‘LTR），那么有没有tat都无所谓，所以二代系统三代系统都能用。

• 但如果你的vector是二代的，也就是正常的5’LTR，你还是需要tat的表达的，因此只能用二代系统。

注意

1. Lentivirus 和retrovirus有什么区别呢？

Lenti是retro的一种，要真说和标准retro的区别的话，那么就是lenti可以感染non-dividing和dividing的细胞，而retro只能感染dividing的细胞，所以lenti的作用更广。

二者都用gag，pol,rev来package，但是因为是不同的病毒，所以用的会有细微的差别（不同的isoform）。

2. 你直接用你的lentivector做一个瞬转成不成？

答案是不推荐。因为很可能由于LTR（比如二代的需要依赖tat），没有tat的情况下，基因表达量会很低。

包毒