一、热图的介绍
（1）什么是热图
热图是heatmap的直译，用暖色表示数值大，冷色表示数值小。行为基因，列为样本。
（2）热图的作用
- 数据质量控制：通过热图，我们能很直观的看到不同分组之间的基因整体表达模式，因此可以迅速地判断同组之间各样本的重复性如何，从而判断实验处理是否正确，数据是否可信可靠符合逻辑。相同实验分组的几个生物学重复应该聚类在一起。
- 直观展示重点研究对象的表达量数据差异变化情况：一次实验中检测到的基因往往成千上万，导致一幅全局性热图的行数也相应地十分庞大，单个基因的表达情况几乎无法辨识，所以用整个数据集画出的热图往往只能用于数据的整体质控。而要能够向读者清晰展示自己所研究的某一批基因的数据分布与变化情况，就应当把自己的研究对象从数据集中找出来再绘制热图，作为重点关注的几个标志性的基因在右侧标注。
- 不要画“没用”的热图，比如图形的展示结果是早可预见的，没用什么意义的热图；用于进行探索性数据分析、提供下游分析处理线索的热图。应该能够解释：这个热图展示的特定的表达模式，说明了哪些生物学功能与信号通路的改变？是什么导致了这些改变？这种改变又会产生什么样的后果？
二、热图中数据的标准化
（1）为什么要标准化
热图的图例是以0为中心，变化范围在±3左右。RNA-seq得到的基因表达量其实差异是非常大的，从个位数到上千，所以首先要对基因的表达量进行归一化，不然我们得需要多大尺度的色阶才能表示这么大范围的变化啊。标准化可以使数据范围缩小，便于用合适的颜色色度进行表示，能避免由于单个数据过大（过小），导致冷暖色分布不明显的现象。
（2）怎样标准化
可以按基因、按样本或全局标准化。一般选择按行（基因）进行标准化。如果对同一行进行标准化，就不能比较同一样品中不同基因的表达（不能比较不在同一行的z-score数值，原来不同基因绝对表达量高的也有可能在同一样品中得到低的z-score分数）。如果没有异常值，也可以进行全局的标准化。
（3）标准化方法
- Z-score scaling（正态标准化）：它代表原始数值和总体均值之间的距离，并以标准差为单位计算。在原始数值低于平均值时Z则为负数，反之则为正数，是一个不受原始测量单位影响的数值，经常用在数据分化比较大的场景。在分类、聚类、PCA算法中，使用z-score值的结果更好。转换后的数据符合正态分布，平均数为0，方差为1。Z-score要求原始数据的分布为正态分布或者近似正态分布。
z-score = (x-μ)/SD - log对数变换：原始的counts矩阵是一个离散型的变量，离散程度很高。即使经过了RPKM/FPKM等方法抵消了一些测序技术误差的影响，但高低丰度基因的表达量的差距依然很大。常用的归一化方法是对数转换log2(counts+1)。加1是因为表达量为0的无法取到对数，而加1后log2(1)还是等于0。转换后不改变数据原本的排序关系，可以在全局进行比较。
- min-max标准化（0-1标准化）：是对原始数据的线性变换，使结果落到[0 , 1]区间。更符合直观认知，使同一行里基因表达最高值为1，最低值为0。
三、热图中数据的聚类
（1）什么是聚类
聚类，就是把相似的东西分到一组。一个聚类算法通常只需要知道如何计算相似度就可以开始工作了，是无监督学习。聚类本质上是集合划分问题。因为没有人工定义的类别标准，因此算法要解决的核心问题是如何定义簇，唯一的要求是簇内的样本尽可能相似。通常的做法是根据簇内样本之间的距离，或是样本点在数据空间中的密度来确定。对簇的不同定义可以得到各种不同的聚类算法。常见的聚类算法有：
- 连通性聚类。典型代表是层次聚类算法，它根据样本之间的联通性来构造簇，所有联通的样本属于同一个簇。
- 基于质心的聚类。典型代表是k均值算法，它用一个中心向量来表示这个簇，样本所属的簇由它到每个簇的中心距离确定。
（2）层次聚类
找出哪两个基因最相似（similar），将它们合并作为一个整体（merge them to a cluster）；再找出哪两个基因最相似，合并成一个整体；重复这个步骤，直到所有的基因都聚成一类。
层次聚类通常会伴随着产生一个系统树图（dendrogram），表示了相似性和聚类的顺序。
（3）相似性如何定义
可以有多种计算距离的方式，如Euclidean distance（欧氏距离）、Manhattan distance等，现实中绝大多数时候会使用欧氏距离。使用包含欧氏距离的聚类算法时，要注意数据的量纲影响，有必要时先进行数据标准化处理。
You need to make sure the scales for each variable are roughly equivalent, otherwise you will be biased towards one of them. The standard practice is to divide each variable by its standard deviation.
（4）聚类如何作为一个整体
- the average（类平均法）：类与另一个类中任两个样品距离的平均值。效果比较好。
- the closest point：single-linkage
- the furthest point：complete-linkage
- centroid（重心）：类的均值与另一个类的均值的距离
- median（中间距离法）
- ward（离差平方和法）
- density（密度估计法）
四、pheatmap（Pretty Heatmaps）
（1）R Script
> library(pheatmap)
> library(RColorBrewer)
> #测试数据
> testdata1[1:5,1:5]
CF1 CF2 CF3 CF4 CM1
rna13468 66.97984 80.07318 54.87525 91.65463 1.401584
rna885 26.53467 44.51450 33.65076 40.72113 60.633389
rna32332 0.00000 37.71825 11.89813 0.00000 1.403419
rna8744 42.44415 52.31791 60.35968 54.00533 39.524090
rna16488 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 0.000000
> #样本信息
> anno_col <- data.frame(Group=c(rep("CF",4),rep("CM",4),
+ rep("PF",4),rep("PM",4)),
+ row.names = colnames(testdata1))
> anno_col$Group <- factor(anno_col$Group,levels=unique(anno_col$Group))
> #基因注释
> head(anno_row)
gene_name chromosome
rna10784 CG13244 2L
rna12885 CG14589 2R
rna13468 CG1882 2R
rna16488 CG8311 2R
rna18953 CG5539 2R
rna20313 CG1317 3L
> anno_row$chromosome <- droplevels(anno_row$chromosome)
> #注释颜色
> Group_col <- brewer.pal(8,"Set2")[2:5]
> names(Group_col) <- levels(anno_col$Group)
> Chr_col <- brewer.pal(8,"Set3")[1:5]
> names(Chr_col) <- levels(anno_row$chromosome)
> ann_colors <- list(Group=Group_col,
+ Chromosome=Chr_col)
> #默认参数绘图
> pheatmap(testdata1)
> #添加注释等
pheatmap( testdata1,
+ scale="row",
+ clustering_method="average",
+ color=colorRampPalette(c("green", "black","red"))(100),
+ annotation_col=anno_col,
+ annotation_row=anno_row[2],
+ annotation_names_row=F, annotation_names_col=T,
+ annotation_colors=ann_colors,
+ border_color = NA)
（2）用法
pheatmap(mat, color = colorRampPalette(rev(brewer.pal(n = 7, name = "RdYlBu")))(100), kmeans_k = NA, breaks = NA, border_color = "grey60", cellwidth = NA, cellheight = NA, scale = "none", cluster_rows = TRUE, cluster_cols = TRUE, clustering_distance_rows = "euclidean", clustering_distance_cols = "euclidean", clustering_method = "complete", clustering_callback = identity2, cutree_rows = NA, cutree_cols = NA, treeheight_row = ifelse((class(cluster_rows) == "hclust") || cluster_rows, 50, 0), treeheight_col = ifelse((class(cluster_cols) == "hclust") || cluster_cols, 50, 0), legend = TRUE, legend_breaks = NA, legend_labels = NA, annotation_row = NA, annotation_col = NA, annotation = NA, annotation_colors = NA, annotation_legend = TRUE, annotation_names_row = TRUE, annotation_names_col = TRUE, drop_levels = TRUE, show_rownames = T, show_colnames = T, main = NA, fontsize = 10, fontsize_row = fontsize, fontsize_col = fontsize, angle_col = c("270", "0", "45", "90", "315"), display_numbers = F, number_format = "%.2f", number_color = "grey30", fontsize_number = 0.8 * fontsize, gaps_row = NULL, gaps_col = NULL, labels_row = NULL, labels_col = NULL, filename = NA, width = NA, height = NA, silent = FALSE, na_col = "#DDDDDD", ...)
（3）参数
- scale="row" #标准化z-score,按行(基因)row/按列column/不标准化none
- cluster_rows=T, cluster_cols=T #默认聚类
- clustering_distance_rows="euclidean", clustering_distance_cols="euclidean" #默认欧氏距离
- clustering_method="complete" #默认最远距离
- color=colorRampPalette(c("green", "black","red"))(100) #红黑绿
- legend=TRUE, legend_breaks=NA, legend_labels=NA #默认图例
- annotation_col=annotation_col, annotation_row=annotation_row, #行和列的注释
- annotation_colors=ann_colors #设置分组颜色
- annotation_legend=T #注释的图例
- annotation_names_row=T, annotation_names_col=F #注释的名称
- show_rownames=T, show_colnames=T #是否显示行名和列名
- border_color = NA #方格边框颜色,默认"grey60" ,NA为不画边框
- treeheight_row=30, treeheight_col=20 #进化树高度,设为0可隐藏进化树
五、ComplexHeatmap
（1）R Script
> library(ComplexHeatmap)
> library(circlize)
> library(RColorBrewer)
> #提前标准化数据
> heatmapdata <- testdata1
> heatmapdata <- t(scale(t(heatmapdata)))
> #heatmapdata[heatmapdata>2]=2
> #heatmapdata[heatmapdata<-2]=-2
默认参数绘图
> Heatmap(testdata1)
> Heatmap(heatmapdata)
热图颜色
> col_fun = colorRamp2(c(-2, 0, 2), c("green", "white", "red"))
> Heatmap(heatmapdata, name=" ", col=col_fun)
> Heatmap(heatmapdata, name=" ", col=rev(rainbow(10)))
边界和网格
> Heatmap(heatmapdata, name=" ", col=col_fun,
+ border=TRUE,rect_gp=gpar(col="white",lwd=2))
渲染聚类树
> #install.packages("dendextend")
> library(dendextend)
> col_dend = hclust(dist(t(heatmapdata)))
> row_dend = hclust(dist(heatmapdata))
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ cluster_columns=color_branches(col_dend,k=4),
+ cluster_rows = color_branches(row_dend, k=4))
组内聚类
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ cluster_columns=cluster_within_group(heatmapdata,anno_col$Group))
分割热图
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ split = anno_row$chromosome,
+ column_split = anno_col$Group)
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ split = anno_row$chromosome,
+ column_split = anno_col$Group,
+ column_title = NULL,
+ row_title_gp = gpar(col="white",fontsize=11,
+ fill=brewer.pal(8,"Set1")[1:5]))
图例
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ heatmap_legend_param = list(legend_height=unit(6,"cm"),
+ grid_width=unit(0.8,"cm")))
简单注释
> ha_col <- HeatmapAnnotation(Group=anno_col$Group,
+ col=list(Group=Group_col))
> ha_row <- HeatmapAnnotation(Chr=anno_row$chromosome,
+ col=list(Chr=Chr_col),
+ which="row")
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ top_annotation = ha_col,
+ left_annotation = ha_row)
复杂注释
> ha_box <- HeatmapAnnotation(boxplot=anno_boxplot(heatmapdata,
+ height=unit(2,"cm"),
+ box_width = 0.9,
+ gp=gpar(fill=Chr_col[anno_row$chromosome]),
+ outline = F),
+ which="row")
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ top_annotation = ha_col,
+ left_annotation = ha_row,
+ right_annotation = ha_box)
标签注释
> ha_lab <- rowAnnotation(gene=anno_mark(at=which(row.names(heatmapdata)=="rna34188"),
+ labels = "CycG"))
> Heatmap(heatmapdata, name=" ",
+ show_row_names = F,
+ right_annotation = ha_lab)
（2）reference
可以去看ComplexHeatmap Complete Reference，非常详细。