Integrative Genomic Profiling Uncovers Therapeutic Targets of Acral Melanoma in Asian Populations
综合基因组分析揭示亚洲人群肢端黑色素瘤的治疗靶点
发表期刊：Clin Cancer Res
发表日期：2022 Jun 13
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-21-3344
一、背景
肢端黑色素瘤是亚洲患者中黑色素瘤的主要亚型，其特点是起病隐蔽，预后差。此前，一些针对欧洲队列的开创性基因组研究已经进行，概述了肢端黑色素瘤的突变特征，这些突变与皮肤黑色素瘤的突变有明显区别。与皮肤黑色素瘤相比，肢端黑色素瘤的总体点突变负担明显较轻。大多数（51%）的肢端黑色素瘤病例被归类为三疣型（TWT；BRAF-RAS-NF1疣型），而这一比例在皮肤黑色素瘤中仅为11%。有研究分析了基因组数据，证明肢端黑色素瘤不是大多数典型肢端黑色素瘤的前体，表明肢端黑色素瘤的进化轨迹与皮肤黑色素瘤不同。
尽管如此，大多数关于肢端黑色素瘤的基因组研究是在西方人群中进行的，而基于亚洲患者的研究则很稀少。此外，正如以前的报告所指出的，复发性CNVs有利于肢端黑色素瘤的驱动基因，将CNVs与相应的临床病理信息相关联，以评估其作为治疗目标的潜力，具有重要意义。
二、材料与方法
1.数据来源
1）所有样本都是来自亚洲患者的肢端黑色素瘤病变，收集自西京医院皮肤科的黑色素瘤数据库；进行下一代测序（NGS）的样本从新鲜冷冻的肿瘤和匹配的相邻正常组织或全血中提取
2）大群体：233个石蜡包埋的肢端黑色素瘤样本，包括54个来自发现群的肿瘤
2.实验流程
1）NGS、变体调用和拷贝数分析
2）突变特征的鉴定、微卫星不稳定性
3）HRD（同源重组缺陷）评分的计算
4）与同源重组修复途径或PARP抑制剂敏感性相关的基因的变体调用和临床注释
5）RNA测序处理和分析管道
三、实验结果
01 - 突变负担和SMGs
WES鉴定了11630个体细胞SNVs和163个体细胞小插入缺失。关于非同义事件（错义，无意义，插入和剪接位点），所有肿瘤样本的中位数为31个突变，肿瘤突变负担（TMB）中位数为每兆碱基1.09个突变（图1A）。通过MutSigCV，发现队列中的NRAS、KIT和BRAF被确定为显著突变基因（SMGs）（q < 0.2）。在这些基因中，KIT获得的体细胞突变频率最高（图1A），KIT的突变分布在多个外显子中（第9、11、13和17外显子；图1B）。BRAF突变主要是V600E替代，还有一个不常见的G466V替代（图1B）。NRAS的SNVs包括Q61R（n = 6）、Q61L（n = 2）和Q61K（n = 1；图1B）。在检测到的4个NF1突变中，有2个是失活突变。只有一个样本同时存在一个热点，即致癌的Q61L NRAS突变和一个不常见的G466V BRAF突变。在发现队列中发现的驱动基因在验证队列中也有平行位点的突变（补充图S1A）。
黑色素瘤中其他一些的潜在致病基因在发现队列中出现了频率较低的体细胞突变，包括CBL、CTNNB1、GNAQ、TRRAP、EGFR、MTOR和TERT（图1A）。值得注意的是，一些潜在的皮肤黑色素瘤驱动基因，包括TYRP1、TP53、PTEN、DDX3X、RASA2、PPP6C、RAC1和RB1，在发现队列中既没有SNVs也没有indel突变，这意味着肢端黑色素瘤的驱动分子事件与皮肤黑色素瘤有明显的不同。
作者发现，溃疡型肢端黑色素瘤组的TMB较高（图1C）。不同程度的淋巴细胞浸润患者的TMB没有明显差异（图1D）。有KIT畸变的样本的TMB高于有NRAS突变的样本或没有任何SMGs突变的样本（图1E）。然后比较了手或脚的指甲黑色素瘤（NAM）和非指甲肢端黑色素瘤（NNAM）的基因突变情况。仅在足部NNAM（n = 40）和足部NAM（n = 5；图1F）之间观察到SNV负担的显著差异。此外，发现基于合并的发现和验证队列（25个NAM和83个NNAM），NAM和NNAM之间三个SMGs占据的比例明显不同。大多数突变的BRAF（91.7%）和NRAS（90%）针对NNAM的样本。NAM样本获得的KIT突变占总数的53.3%，分别明显高于BRAF-、NRAS-和其他基因-突变亚组（图1G）。
作者利用HLA-PRG、NetMHCpan和pVAC-Seq整合肿瘤突变和表达数据（DNA测序和RNA-seq）的计算工作流程，用于识别发现队列中的新抗原（补充图S2A）。按照顺序，在有匹配的RNA-seq的肿瘤中（n = 37），肢端黑色素瘤的新抗原负荷和突变负担之间没有观察到明显的相关性（补充图S2B）。值得注意的是，新抗原在不同淋巴细胞评分的肿瘤中明显不同（补充图S2C和S2D），然而NAM和NNAM之间的新抗原没有表现出明显的差异。
02 - 肢端黑色素瘤的突变特征和DNA损伤修复缺失
对发现队列的突变谱的分析突出了C>T转换是主要的体细胞碱基替换，这在包括皮肤黑色素瘤在内的大多数癌症中也有观察到（补充图S3）。然而，仅有17.2%至41.6%的C > T转换发生在双嘧啶位点，这比典型的紫外线诱导的突变特征（约60%）低得多（图2A），CC>TT突变的比例也同样低于公认的阈值。因此，紫外线可能不是亚洲人群中肢端黑色素瘤的主要突变因素。
为了确定最可能作用于肢端黑色素瘤发展的突变过程，作者在COSMIC V2数据库中使用deconstructSigs确定了六个单碱基替换的突变特征（图2A）。在已识别的特征中，Signature 3代表双链断裂（DSB）的HRD，并且已经在粘膜黑色素瘤和TWT黑色素瘤中被策划出来。在33个被确认为具有Signature 3的样本中，19个样本显示Signature 3的贡献率超过25%，在进一步的SigMA验证中，10个样本同时被Signature 3注释（图2A）。之前在肢端黑色素瘤中发现的与年龄有关的Signature 5在发现队列中是最普遍的。结果中提出的另外四个Signature （16、9、12和20）以前没有在黑色素瘤中被发现。尽管病因不明，但Signature 16只在肝癌中被描述过，在26个肢端黑色素瘤标本中的贡献率超过25%。Signature 9与聚合酶η有关，在体细胞高突变过程中具有激活诱导的脱氨酶活性，Signature 12也被标记为未知病因，在大多数被注释的样本中贡献较小。最后，只有12个肿瘤被Signature 20所注释，它与DNA错配修复缺陷有关。双碱基替换（DBS）Signature 分析确定DBS11（APOBEC诱变）是最相似的特征。而小的indel-signature分析共确定了四个Signature ，包括ID8、ID10、ID12和ID16（后三者病因不明）。ID8被确定为基于非同源重组的末端连接机制的DNA DSB修复的特征，它在缺乏有效的HRR时补偿性地修复DSB。此外，deconstructSigs分配给COSMIC V3.2也检测到一些肢端黑色素瘤标本具有HRD相关的Signature 3。值得注意的是，在发现队列中，使用分配给COSMIC V2或V3.2的deconstructSigs没有发现与紫外线辐射相关的Signature 7相似的突变特征，尽管在以前的研究中，它被报告为主导大多数皮肤黑色素瘤和部分尖顶黑色素瘤样本。
为了寻找导致观察到的HRD的潜在基因改变，作者检查了这60个病例是否存在任何有害的改变。此外，还分析了相同位点的LOH（最常见的二次攻击事件）状态。关于HRD相关基因的改变，2名患者携带了BRCA2的致病种系变体（分别为野生型等位基因LOH的无意义和框架转换插入）。两名患者携带FANCA（一个负责DNA链间交联修复的基因）种系突变，其中一个是框架移位缺失，而另一名患者则与FANCA的LOH无关。在七个肿瘤中观察到RECQL4的种系突变，该基因在修复DNA DSBs时促进DNA末端切除。在确定的体细胞突变中，在14个样本中观察到EMSY的拷贝数增加。在患者群中还发现了ZSWIM7（生殖系，框架移位插入与LOH）、WRN（体细胞，同型缺失）和MAPK12（体细胞，同型缺失）的其他突变（图2A）。此外，HRD相关的突变事件在Signature 3+肢端黑色素瘤病变中富集。
作者继续利用相应的生物标志物指数来确定HRD，包括HRD-LOH、大规模状态转换（LST）、端粒等位基因不平衡（TAI）的数量，以及三个分数的组合（HRD-sum）。在Signature 3+肢端黑色素瘤病变与其他病变的比较中，HRD-LOH事件的数量、TAI和LST没有明显差异，而Signature 3+病变往往具有较高的HRD-sum值，具有边缘意义（图2B）。值得注意的是，肢端黑色素瘤病变的HRD-sum值分布与先前研究报道的BRCA1缺陷的三阴性乳腺癌（TNBC）样本的情况相似，并且明显高于BRCA2缺陷和非BRCA1/2缺陷组（图2C），远高于Signature 3富集的TWT黑色素瘤的报告值，因此暗示肢端黑色素瘤可能存在HRD导致的基因组不稳定特征。作者还发现HRD总和与受CNVs影响的基因组百分比之间存在正相关（图2D）。此外，19.4%的TWT肢端黑色素瘤和12.5%的非TWT肢端黑色素瘤样本被鉴定为Signature 3+，它们之间没有统计学意义（图2E）。对于推定的错配修复缺陷，作者试图确定在聚合酶校对和错配修复途径（POLE、POLD1、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）中存在突变的肿瘤，但这些基因的改变没有被发现。接下来，用mSINGS和MSIsensor的生物信息学方法测量了体细胞微卫星不稳定性指数。然而，所有60个肢端黑色素瘤样本都没有显示出显著升高的微卫星不稳定性水平（补充图S7A和S7B）。因此，错配修复缺陷可能对亚洲人群的肢端黑色素瘤影响不大。
03 - 肢端黑色素瘤的拷贝数改变和信号通路的激活
受CNVs影响的基因组的百分比是变化的，中位数为14.2%（图3A）。使用GISTIC共确定了110个复发性病灶CNVs（补充图S8）。主要的增益事件包括KIT、KDR和PDGFRA在4号染色体（Chr）上的同一扩增子；5号染色体上的TERT；CCND1、GAB2和YAP1；CDK4和MDM2在Chr 12；和EP300在Chr 22，主要损失事件包括CDKN2A在Chr 9和NF1在Chr 17。上述同时提到并包括在靶向深度测序中的基因的CNV频率与验证队列中的基因大致一致。有趣的是，有57.1%的CDK4拷贝数增加的样本同时出现了MDM2的增加。
作者比较了发现队列中NAM和NNAM的CNVs模式。在NAM中检测到含有致癌基因KIT的4q12灶性增殖，其意义不大，而在NNAM中，观察到TERT、EP300和CDK4的拷贝数明显增加（补充图S9A）。除了淋巴细胞得分低组（淋巴细胞得分=0或1，n=28）所包含的复发性拷贝数畸变区域外，在淋巴细胞得分高组（淋巴细胞得分=2或3，n=30；补充图S9B）中检测到含有致癌基因KIT的4q12和含有PAK1的11q14.1的局灶性增益，具有重要意义。
作者整合了SNVs和CNVs来识别反复出现的靶向通路，发现受影响最大的三个信号通路，包括MAPK、细胞周期进展和组蛋白修饰（图3B和C）。获得组蛋白修饰途径的CNVs的患者往往有较差的总生存期（OS），尽管没有意义（图3D）。
04 - EP300的基因畸变与p300抑制剂的反应性有关
根据癌症基因组图谱，与皮肤黑色素瘤和其他癌症相比，肢端黑色素瘤的EP300拷贝数增加频率更高。为了进一步评估EP300通路畸变与肢端黑色素瘤临床病理特征的相关性，作者通过在一个更大的患者群中进行FISH检测（233个石蜡包埋样本，包括54个来自发现群的肿瘤），验证了肢端黑色素瘤中受拷贝数增加影响的EP300及其关键下游靶点MITF的频率。EP300和MITF的拷贝数增加的频率分别为24.5%和7.3%，30%的肢端黑色素瘤病变样本携带EP300-MITF轴的拷贝数增益。在具有不同EP300通路CNV的患者之间，没有观察到中位年龄和性别分布的显著差异。然而，与对照组相比，发现在携带EP300增益的亚组中，Breslow厚度明显增加，或两者都有。同时，与对照组相比，溃疡在EP300-MITF轴增益的肿瘤中明显富集。此外，EP300拷贝数增加的患者表现出III/IV期比例较高的趋势，具有边界意义。这些结果表明，EP300通路拷贝数增加的肢端黑色素瘤往往更具侵略性。
作者在发现队列中37个肢端黑色素瘤的RNA-seq数据中发现了EP300拷贝数和p300表达水平之间的正相关（图4A），这也被CCLE数据库的结果证实（图4B）。此外，MITF的表达水平也与EP300的拷贝数明显相关（图4C）。观察到A485（一种p300特异性抑制剂）在黑色素瘤细胞系MM34、XYAM-4、SKMEL-1和A2058（前两者是肢端黑色素瘤细胞系；图4D）中以剂量依赖的方式抑制组蛋白H3K18和H3K27的乙酰化以及MITF的表达。然而，A485治疗只能阻断有EP300增益的细胞系（MM34和SKMEL-1）的细胞周期进展，而不是没有EP300-MITF轴增益的细胞系（图4E），这表明A485对黑色素瘤的抑制作用与EP300-MITF轴畸变有关。为了评估A485对黑色素瘤的抑制作用，作者在具有各种EP300通路变异的黑色素瘤细胞系中测试了A485的IC50值。注意到含有EP300增益或MITF增益或两种基因增益的细胞系对A485明显比没有EP300/MITF增益的细胞系敏感（图4F-H）。另外，对A485敏感的细胞系中，EP300和MITF的拷贝数都明显高于不敏感的细胞系。因此，EP300途径的拷贝数增加可能是肢端黑色素瘤对p300抑制剂敏感性的生物标志。有趣的是，尽管据报道MITF下调会使肿瘤细胞转换为更具侵略性的表型，但Western blotting结合Transwell检测显示，在MITF表达下调的情况下，A485没有改变四个细胞系的入侵或迁移能力（图4D）。
05 - EP300增益反映了肢端黑色素瘤对抗PD-1治疗的反应性
作者利用37个肢端黑色素瘤样本的RNA-seq数据，通过xCell评估了瘤内免疫细胞组成。结果发现，没有EP300增益的肢端黑色素瘤样本被更多的中性粒细胞浸润（图5A）。GSEA发现，在EP300增殖的样本和正常样本之间，几个途径的基因表现出明显不同的表达，其中丰富的炎症反应途径表明EP300拷贝数增殖和 "smoldering"的炎症环境之间存在负相关，可能支持肢端黑色素瘤免疫逃逸演变（图5B）。进一步的分析显示，EP300获得的样本的促炎症基因的表达减少（图5C-F）。根据CCLE数据库，IL1B、IL1RN和PTGS2的表达水平与EP300的拷贝数呈负相关（图5G-I）。此外，实时定量PCR的结果表明，EP300被siRNA干扰后促进了IL8的表达（图5J）。
作者推测IL8下调的肢端黑色素瘤可能对抗PD-1治疗更敏感。免疫评分（IPS）是一种基于机器学习的评分方案，它可以在计算机预测患者对ICB的反应。使用IPS值的两个亚型（IPS-PD-1/PD-L1/PD-L2_pos和IPS-CTLA-4_pos）作为黑色素瘤患者对抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4治疗反应的代用指标。在这个预测模型中，对抗PD-1/PD-L1和抗CTLA-4治疗反应的相对概率在IL8高的组别中较低（图5K）。结果表明，肢端黑色素瘤中EP300拷贝数增加和IL8表达下调的患者可能对ICB治疗有反应。
06 - 肢端黑色素瘤发展中基因变化的时间排序
通过PhylogicNDT对队列中所有样本的这些顺序进行组合，有助于描述体细胞突变获得的概率顺序（图6A）。发现高度富集的拷贝数事件发生在关键编码突变形成之前，10q、10p和16p臂的损失是最早的事件之一，其次是许多染色体的损失或增加。KIT、BRAF和NRAS的突变往往发生在中间时间点，而其他罕见的驱动突变则被认为是后来发生的事件。
依次地，按反映肢端黑色素瘤进展的Breslow厚度对肿瘤进行分层，发现SNV和受CNVs影响的基因组百分比【拷贝数增加（CN≥3）和拷贝数丢失（CN≤1）】随着肢端黑色素瘤的进展而显著增加（图6B和C）。具体来说，8q24.22和7p11.2的拷贝数畸变频率在Breslow厚度较高的样本中明显较高（图6D）。亚克隆SNV突变的比例在Breslow厚度较深的肢端黑色素瘤样本中明显较高（图6E和F），表明在这些肿瘤中，SNV亚克隆群体的遗传异质性更强。
ABSOLUTE在发现队列的60个肢端黑色素瘤标本中的45个样本中鉴定了56个驱动SNVs（仅有错义突变）的克隆状态（图6G）。45名患者中有29人是克隆突变的携带者（29人中有2人有额外的亚克隆），其余16人携带孤立的亚克隆点突变。在所有获得这种改变的肿瘤中，KIT的驱动突变是克隆性的（n = 9），这意味着KIT突变是肢端黑色素瘤进化史中的一个早期和关键的SNV事件。此外，一组突变基因如BRAF、NRAS和NF1被确认为分别包括克隆性和亚克隆性突变。
四、结论
总的来说，这项WES研究提供了一个来自亚洲患者群体的肢端黑色素瘤病变的基因组畸变概况。肢端黑色素瘤的突变特征表明，DNA损伤修复缺陷如HRD可能与肢端黑色素瘤的发展和进展有关。该研究还确定了受拷贝数增加影响的EP300-MITF轴在临床上是可以靶向的。此外，为了澄清肢端黑色素瘤的克隆结构，有必要在进行基因靶向治疗之前，对患者的突变驱动基因的克隆状态进行分析。