外泌体鉴定

1.外泌体鉴定的方法有哪些？

1）透射电子显微镜（TEM）。

2）Nanosight粒径分析（NTA）。

3）Western blot鉴定。

2.纳米流式可以提供哪些检测服务？

1）纳米流式可以作为普通 NTA，检测外泌体的粒径和粒子浓度。

2）可以对外泌体进行标记后，通过激光进行荧光信号的激发，从而进行荧光层面 的检测，例如通过 FITC 荧光抗体标记外泌体 CD63，检测外泌体 CD63 的粒子数，从而统计 CD63 的阳性率。

3.外泌体标志性蛋白是外泌体上独有的么？

不是。这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，多数是膜蛋白或者是 ESCRT复合体成员及其相关蛋白，他们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，因此细胞中自然也会存在。只是因为外泌体的形成依赖于这些分子，因此这些分子在囊泡中发挥功能，因此在囊泡中丰度要明显比细胞中更高一些。

4.提取的外泌体进行Western Blot前是否需要加入RIPA试剂裂解？

不需要，外泌体在wb之前的制样过程中有煮样步骤，该操同样会对外泌体有裂解效果。

5.WB实验会有阳参样本的设置吗？

我们会在一张膜上设置1个阳参样本，不会针对每个客户的项目都设置阳参。如果客户有需求，一般我们有超离制备的细胞上清外泌体作为阳参样本，阳参的设置主要是为了评估实验体系是否成功，排除由于人为操作引起实验失败。

6.做透射电镜的注意事项有哪些？

1）样品纯度越高，TEM结果越好；

2）不同体液来源、不同分离方法得到的EVs稀释倍数有所不同；

3）盐结晶会影响样品导电率，负染前用DI水清洗铜网上的EVs；

4）拍摄电镜图片时，要注意将外泌体与其他颗粒区分开。

7.电镜的染色方法是什么？

一般是负染法，使用的试剂主要是醋酸双氧铀，效果较好。

8.外泌体电镜是不是一定要有膜结构，无膜结构的球体对不对？

负染电镜结果中外泌体的形态肯定是那种明显的茶托样或者大饼样的，边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果打到的结构是没有膜结构的圆球形，那么很可能是脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。

9.超速收集上的外泌体，电镜下没有找到外泌体的原因可能是什么？

超速离心提取外泌体的量低于外泌体沉淀试剂提取，而且本身细胞培养上清中外泌体的含量很低，所以分离出来的外泌体不容易找到，在进行电镜检测的时候可以减少稀释倍数甚至是浓缩外泌体悬液后再进行检测。