一种与心血管疾病相关的肠道微生物代谢物通过肾上腺素能受体发挥作用

近几年来，肠道菌群的相关研究很是火热，肠道微生物已被证明影响众多疾病的进程。2020年3月，美国克利夫兰医学中心的Stanley Hazen在Cell又发一篇肠道菌群与心血管疾病相关的研究，下面我们一起看下这篇文章的研究内容及其研究思路。

1、研究背景

心血管疾病（CVD）是全球死亡率较高的疾病之一。在过去的研究中发现，二型糖尿病（T2DM）病人有更高的CVD和重大心脏不良事件（MACE）风险，像血糖这样的传统T2DM监测指标并不能很好地预测CVD的风险。

2、研究目的

研究肠道菌群在心血管疾病的发生发展中的作用及相关机制。

3、方法和结果

作者首先通过代谢组学研究鉴定出苯丙氨酸被肠道微生物代谢为苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），并鉴定出相关基因进一步研究其机制，发现PAGIn可通过G蛋白偶联受体增加血栓形成的潜力。

4、研究内容

非靶向代谢组学鉴定出PAGln与CVD相关

作者首先采用非靶向代谢组学对1162个受试者的血浆进行分析，其中糖尿病患者257人，3年内经历MACE患者116人。研究结果发现，一种未知的代谢物，其质核比为265.1188的物质在目标个体中都存在，并且发现这种物质在糖尿病患者和MACE患者中显著升高，于是对该代谢物进行鉴定，发现为PAGln。接下来的研究中作者通过采用液相色谱串联质谱结合同位素示踪法对另外4000个个体进行靶向验证，发现PAGln与T2DM引起高风险CVD具有相关性。

肠道菌群在体内参与PAGln和苯乙酰甘氨酸的形成

接下来作者研究了肠道微生物与PAGln生成的相关性。作者对人体不同条件下的PAGln水平进行对比，其中包括人体基线水平（Pre-Abx）、7天复合抗生素处理（Abx）和3周恢复期（Post-Abx这三种情况），发现PAGln的水平在这三种情况下存在显著差异，说明肠道菌群的改变影响了人体中PAGln的生成。已有文献报道苯乙酸（PAA）与谷氨酰胺（Gln）可在肝脏酶的作用下形成PAGln，细菌分解苯丙氨酸（Phe）产生PAA。PAA也可与甘氨酸（Gly）结合形成苯乙酰甘氨酸（PAGly）。通过检测发现，人体中的PAGln含量更高，而小鼠中PAGly的含量高，在无菌鼠中这两者的含量均减少，这也验证了微生物参与二者的合成。

PAGln增强血小板刺激诱导的钙释放和对多种激动剂的反应性

PAGln 水平与CVD之间具有正相关关系，作者推测PAGln 可能对血小板功能以及血管基质具有潜在的影响。因此，作者研究了PAGln是否影响血小板对全血胶原表面的粘附。结果发现，PAGln 和 PAGly 显著影响血小板功能，增强血小板对胶原蛋白基质的粘附力，以及钙离子的血小板刺激依赖性上升和对激动剂的聚集。

PAGln加速血小板凝集形成并增强体内血栓形成潜力

作者使用 FeCl3 诱导的颈动脉损伤动物模型验证了PAGln 和 PAGly 对小鼠体内血块形成的影响，实验发现PAGln可加剧颈动脉血栓形成。紧接着作者研究了有助于宿主内 PAGln / PAGly 生成的基因和基因是否可以在体内调节血小板功能和血栓形成潜力。据文献报道Phe主要由产孢梭菌代谢为PAA和苯丙酸（PPA），参与反应的酶主要是由porA或fldH基因编码。作者接下来构建缺乏porA或fldH基因功能的产孢梭菌突变株，结果发现，porA主要影响PAA生成，而fldH基因主要影响PPA的生成。缺乏fldH基因可显著影响血栓形成。

PAGln通过G蛋白偶联受体发挥作用

由于 PAGln 表现出与细胞的受体-配体相互作用的特性，接下来的研究发现PAGIn可影响cAMP水平，PAGIn的结构类似儿茶酚胺，预示PAGIn可能是通过相关G蛋白偶联受体起作用。实验中作者进一步采用SiRNA和阻断剂，发现PAGln作用于G蛋白偶联受体，包括α2A、α2B和β2-肾上腺素能受体（ADR），从而引起下游细胞反应。

选择性ADR抑制剂可减轻PAGln引起的血小板反应过度和血栓生成

为了进一步确认 PAGln 通过 ADR 发挥作用，作者通过在人类胚胎肾细胞（HEK293）中单独过表达 α2A，α2B和β2 ADR进行了功能研究，研究发现PAGln 可以通过 α2A，α2B和β2 ADR诱导细胞应答。之后作者使用抑制ADR的β受体阻断药，研究发现β受体阻断药可显著减少PAGln诱导的高血栓形成风险。

总结：

首先作者通过采用非靶向代谢组对T2D和CVD个体进行检测，鉴定出与CVD风险相关的未知代谢物PAGln；然后采用进行靶向代谢组对该代谢物进行验证；之后的研究发现PAGln的合成的与肠道微生物相关，并进一步鉴定出关键基因fldH；动物模型实验进一步证明PAGln可增加血栓形成潜力，进而通过细胞功能等相关实验研究发现PAGln是通过α2A、α2B和β2- ADR等G蛋白偶联受体起作用。

●文章思路●

1、非靶向代谢组学鉴定差异代谢物，靶向代谢组学进行验证；

2、研究目标代谢物与肠道微生物的相关性；

3、动物模型验证；

4、研究相关基因；

5、探究分子机制。