资源有限进行一种集成的等温核酸扩增检测HPV16和HPV18的DNA

今天给同学们分享一篇实验文章“An integrated isothermal nucleic acid amplification test to detect HPV16 and HPV18 DNA in resource-limited settings”，这篇文章发表在Sci Transl Med期刊上，影响因子为17.1。

结果解读：

HPV16和HPV18 RPA检测可以在每个反应中检测到50-500个拷贝

作者使用RPA测定设计软件PrimedRPA（28）为HPV16和HPV18的E7基因设计了候选的RPA nfo引物和探针组合。作者通过实验筛选引物和探针的组合，以最大化分析灵敏度和特异性，首先在单重复合格式下进行，然后在多重复合格式下进行。优化后的多重复合引物组合的性能见图1，并在表S1中包含序列。HPV16的RPA测定可可可靠地检测到每个反应中50个299-bp合成gBlock（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）的HPV16 DNA或从SiHa细胞中提取的500个HPV16转录本。HPV18的测定可可可靠地检测到每个反应中50个328-bp合成gBlock的HPV18 DNA或从HeLa细胞中提取的50个HPV18转录本（图1A-B）。两个测定的检测限符合digene HC2基准，每个反应1,000个拷贝。在这种RPA nfo测定格式中，探针和反向引物各含有一个双标记扩增子上的抗原标签，该扩增子被捕获在夹心侧流分析中。HPV18检测的更高灵敏度可能是由于探针和反向引物（也称为“切割”产物）之间的扩增效率较反向引物和正向引物（“未切割”产物）更有利（图1C）。未切割产物只包含了侧向流动检测中所需的一种抗原标记，因此，产生的未切割扩增子不会与侧向流动试纸上的抗体结合（图S1）。

HPV16和HPV18检测是针对特定基因型的

作者发现多重HPV16和HPV18检测与其他高风险和低风险HPV基因型的交叉反应较低。如图1D中虚线框所示，只有当存在基因型特异性靶标时，HPV16和HPV18反应才会在适当的测试线上形成产物；这满足了起始拷贝数为10 6 DNA拷贝/反应时与非靶向HPV基因型无交叉反应的特异性基准。

样品制备：无色肽酶（ACP）对细胞裂解非常有效，并且与RPA直接扩增兼容

作者HPV测试的输入是通过宫颈阴道拭子收集的细胞，这些细胞必须首先被裂解以释放用于检测的DNA。为了确定与下游等温扩增兼容的裂解策略，作者使用培养细胞和通过宫颈阴道拭子收集的保存细胞比较了几种化学和酶裂解方法的效果（图S2）。在大多数宫颈癌筛查项目中，宫颈阴道拭子直接收集到保存介质中。对于保存在SurePath或PreservCyt介质中的细胞，作者发现酶裂解方法最为有效（图S2）。在测试的酶裂解方法中，作者发现无色肽酶（ACP）需要最短的孵育时间，因此被认为是最适合于点对点测试的方法。先前的研究表明，ACP是一种有效的裂解剂，并且与点对点使用兼容（21, 29, 30）。作者证明了在较低的失活温度75°C下，ACP提供了有效的裂解，这简化了点对点仪器的开发（图S2）。在这种修改后的加热曲线下，作者发现ACP提供了与探针超声波裂解标准相当的裂解效果（图2A）。此外，作者证明了经ACP处理后产生的细胞裂解液可以直接在HPV16的RPA检测中进行扩增（图2B）。

定制的与NATflow兼容的侧流试纸与市售侧流试纸的性能相当

作者开发了定制的侧流试纸，用于与NATflow检测芯片（31）配套使用。HPV16试验线含有固定的抗荧光素（FAM）抗体，当存在时，它可以捕获标记有FAM的HPV16扩增子。HPV18试验线含有固定的抗地高辛（DIG）抗体，当存在时，它可以捕获标记有DIG的HPV18扩增子。控制线含有固定的生物素化抗小鼠抗体，它与两个扩增子上的生物素标记一起，可以捕获与链球菌素偶联的金纳米壳。因此，控制线在有或无目标DNA检测时都会产生比色信号，而HPV16和HPV18试验线只有在RPA nfo反应中存在扩增的双标记目标DNA时才会产生比色信号。捕获化学反应的改进来自商业可获得的Hybridetect 2侧流试纸（Milenia Biotec，德国吉森），其在第一试验线、第二试验线和控制线上固定了链球菌素、抗DIG和抗兔抗体，而金纳米颗粒报告物则含有抗FAM抗体。

作者比较了定制的NATflow兼容侧流试纸与Hybridetect 2侧流试纸的分析灵敏度，并发现使用定制的NATflow兼容侧流试纸的检出限与使用Milenia侧流试纸的检出限相当（图S3）。

测试集成：扩增和侧向流动检测结合在一起，放置在集成的NATflow平台上，每个反应的检测限为500-1,000个输入拷贝

作者将HPV扩增和检测试验整合到NATflow平台上（Axxin Pty Ltd）。NATflow系统由一个消耗性试剂盒和一个带有集成计时器的双温度加热块组成（图3A）。试剂盒有三个组成部分：裂解管、扩增室和侧流试剂盒。可以使用可选的侧流阅读器（Axxin Pty Ltd. AX-2X-S）来提高分析灵敏度并减少用户间的变异性。在作者的工作流程中，作者还使用了一个小型离心机进行样品制备（图3B）。所有的试剂，包括裂解、扩增和扩增产物检测的试剂，都是冻干的。在NATflow平台上的HPV测试工作流程如图3C和视频S1所示。

集成的NATflow芯片可可靠地检测500-1,000个目标DNA的输入拷贝

将基于RPA的检测方法整合到完全封闭的样本到结果测试中涉及两个挑战：首先，RPA反应需要被稀释以便通过侧流纸条进行检测；其次，RPA的效率在孵育过程中需要搅拌来提高。先前的研究表明，减少RPA反应体积是搅拌的有效替代方法（33, 34）。通过采用这种方法，作者优化了洗脱缓冲液体积、反应体积以及金纳米壳体积，以最大化信号强度并降低测试成本（图S4）。

为了评估经过优化的、集成的NATflow芯片的性能，作者将扩增试剂和金纳米壳冷冻干燥，并将所有冷冻干燥的测试组分存放在干燥的箔袋中。作者分别从SiHa和HeLa细胞中提取的HPV16和HPV18 DNA输入拷贝数量在100到10,000之间进行了测试（图4A）。作者进行了三次重复实验，发现在每个10μL反应中至少有1,000个目标输入拷贝的可靠检测结果（图4B）。

侧向流动试纸在室温下保持稳定，至少一个月

作者评估了使用优化的结合缓冲液（含有5%葡聚糖和5%牛血清白蛋白）的自定义NATflow兼容侧流试纸的稳定性。组装好的试纸存放在密封的铝箔袋中，内含干燥剂，存放在两种条件下：室温（20-23°C）和高温高湿（37°C）。作者发现，在这两种条件下，试纸的信号在一个月的存储期间保持为阳性（图S6）。

Sample-to-answer NATflow测试在高资源环境中，能够检测到提供者采集的宫颈阴道拭子中的500-1,000个HPV16和HPV18拷贝

作者在NATflow平台上展示了对保存和非保存的细胞样本进行HPV16和HPV18测试的样本到答案的过程。简单来说，将10μL的裂解液或上清液加入到NATflow扩增室中的冻干RPA试剂中，并将其放入NATflow加热块的扩增室中，在39°C下孵育20分钟。然后将扩增室倒置并扭入侧流试纸盒中，使扩增产物溶解到侧流试纸上。15分钟后，通过目视读取试纸结果，并使用平板扫描仪和AX-2X侧流读取器（Axxin Pty Ltd）扫描侧流试纸盒。

测试提供者收集的保存在保护剂中的宫颈阴道拭子的结果总结如图5所示。通过基因型特异性的HPV qPCR检测方法（图S7），对每个反应中的HPV DNA拷贝数进行了定量。只有之前通过标准护理测试Roche cobas HPV测试呈阳性的样本才进行了qPCR定量。在保存的样本中，综合RPA测试检测到12个样本中的12个样本每个反应中的HPV16 DNA拷贝数大于1,000个，并且在2个样本中的1,000-500个HPV16 DNA拷贝数的反应中检测到了1个样本。对于6个每个反应中的HPV16 DNA拷贝数少于500个的样本以及所有9个HPV16阴性的临床样本，综合测试结果为阴性（图5A）。综合测试检测到了1个每个反应中的HPV18 DNA拷贝数为500-1,000个的样本。对于2个每个反应中的HPV18 DNA拷贝数少于500个的样本以及所有27个HPV18阴性的临床样本，综合测试结果为阴性（图5B）。根据qPCR定量的起始拷贝数进行分层，对于每个反应中至少有1,000个拷贝的样本，HPV16的敏感性为100%，对于每个反应中至少有500个拷贝的样本，敏感性为93%。HPV16的测试特异性为100%。HPV16的阳性和阴性预测值分别为86%和56%。由于HPV18阳性样本数量较少，无法对其敏感性和预测值进行可靠的表征，但HPV18的特异性为100%。在保存样本中，NATflow和cobas对HPV16和HPV18的总体一致性百分比为85%。所有不一致的样本反应中，每个反应的拷贝数均少于500个，而假阴性的起始HPV DNA量低于真阳性（图5C）。图S8和S9中包含了芯片图像。

在莫桑比克马普托进行的自采样现场评估中，检测到80%的样本Ct值低于35

开发的HPV16/18 NATflow测试经过优化，适用于低资源环境下使用患者采集的样本，并在莫桑比克马普托的Mavalane综合医院进行了评估。NATFlow的结果与基于GeneXpert测试的复合黄金标准进行了比较，对于GeneXpert检测中HPV 18/45阳性的样本，仅进行了Ampfire基因分型。样本由进行初级宫颈癌筛查的妇女自行采集，并放入PreservCyt保存液中。在这种环境下，方法的改变包括较长时间的离心（10分钟），ACP孵育后的较高温度（95°C），并且处理后的上清液在测试前不稀释。

现场评估的结果总结如图6所示。GeneXpert和RPA对HPV16的检测结果没有差异（p=0.80，精确的McNemar卡方检验）。整合的RPA测试在以下情况下检测到HPV16 DNA：在GeneXpert Ct值小于30的5个样本中有4个检测到，Ct值在30-35之间的7个样本中有6个检测到，Ct值大于35的5个样本中有1个检测到。此外，HPV16检测在38个阴性样本中的34个样本中呈阴性，即对所有HPV基因型阴性、对HPV18阳性或对其他高危型HPV基因型阳性的样本呈阴性（图6A）。

总结

通过展示一种有效的解决方案，将样品制备、等温扩增和侧流检测整合在一起，适用于资源有限的环境，这项工作代表了朝着能够在资源有限的环境中进行临床应用并实现规模化的宫颈癌筛查测试迈出的重要一步。通过加入额外的基因型、优化样品制备和进行额外的现场测试，该测试的格式和价格可扩大宫颈癌筛查在资源有限的环境中的分散程度和覆盖范围，这是追求全球宫颈癌消除的关键一步。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎咨询！