支原体检测

哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。FDA要求申报实验中细胞每个批次都要求支原体阴性。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。足以见得，支原体检测是保证细胞质量的基础措施。

目前市场化的支原体检测方法主要分为两类，下面对比一下各自的特点。

（1）检测支原体特异性酶的方法，比如Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit。此方法20分钟完成，耗时短。plus加强版检测灵敏。主要缺点是发光值有一定的波动，处于检测下限边缘的读值可能会造成误判。

（2）PCR法，比如TaKaRa公司的PCR Mycoplasma Detection Set。此法灵敏度虽然很高，但是耗时长，巢式PCR两轮和琼脂糖电泳检测，共6-7小时，耗时一整天。同时PCR法导致的假阳性大家比较熟悉，无需多说。值得注意的是，由于细胞培养液中，经常会含有强烈抑制PCR扩增的代谢产物，如果不进行样品的前处理而直接使用细胞培养原液进行PCR检测，产生假阴性的概率是非常大的。因此，PCR法需要必要的阴性和阳性对照，且防止交叉污染。

待测样品的准备：为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品最好来源于至少培养2天（最好3天）且汇合度在70-90%左右的细胞培养上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，至少让细胞生长2天（最好3天）再取培养液进行离心检测。

      注：收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃可以长期保存。此外，为了节约检测成本，可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起检测。