- 原文：Volatile Metabolites of Pathogens: A Systematic Review
- 作者： Lieuwe D. J. Bos , Peter J. Sterk, Marcus J. Schultz
- DOI: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003311
- 作者单位： Department of Intensive Care, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands
摘要
- 理想情况下，在重症患者中尽早检测到入侵细菌：可以快速识别出病原体的菌株，并且在开始新的抗菌治疗之前就已经知道了抗菌敏感性。细菌具有独特的新陈代谢，其中一部分导致细菌特异性挥发性有机化合物（VOC）的产生，可用于诊断目的。挥发性代谢物可以直接在呼出空气中进行调查，从而可以进行无创监测。这篇综述的目的是概述脓毒症中六种最丰富和致病性细菌产生的VOC，包括金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，粪肠球菌，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。此类VOC可用作重症患者诊断方法中的生物标记。对现有文献的系统评价揭示了31篇文章。所有六个目标细菌均产生异戊醇，甲醛，甲硫醇和三甲胺。由于人类不产生这些挥发性有机化合物，因此它们可以作为这些病原体存在的生物学标记。发现以下挥发性生物标记物可用于鉴定特定菌株：金黄色葡萄球菌的异戊酸和2-甲基丁醛；用于铜绿假单胞菌的1-十一碳烯，2,4-二甲基-1-庚烷，2-丁酮，4-甲基喹唑啉，氰化氢和甲基硫氰化物；以及用于大肠杆菌的甲醇，戊醇，乙酸乙酯和吲哚。值得注意的是，未控制可能影响VOC产生的几个因素，包括使用的培养基，细菌生长期和细菌菌株内的基因组变异。总之，细菌产生的VOC可以作为其存在的生物学标记。应该进行目标明确的研究，以识别潜在的挥发性生物标志物集，并评估这些标志物在重症患者中的诊断准确性。
引言
- 介绍脓毒症在发达国家越来越普遍，每年影响每十万人中有240人[1]。尽早开始靶向抗生素可降低死亡率[2]。然而，在大多数情况下，由于诊断不足，经验性抗生素治疗没有针对性，与靶向抗生素治疗相比，死亡率增加了三倍[3]。理想情况下，应尽早发现病原体的入侵。迅速识别出致病性病原体的菌株，并迅速了解抗菌敏感性，最好在开始进行抗菌治疗之前。但是，培养物可能需要几天才能变成阳性，并且敏感性有限，特别是在由于先前感染而已经接受抗生素治疗的患者中[4]。另外，污染可能导致假阳性结果，因此可能会增加不必要的抗生素处方[5]。革兰氏染色结果和直接细胞检查（例如，支气管肺泡灌洗液）可快速获得，但敏感性和特异性有限，既不能告诉病原体确切的菌株，也不能告知其抗菌敏感性[6]，[7]。这些缺点也适用于几种生物标记物（C反应蛋白，降钙素原，肾上腺髓质素原和内毒素）[8-10]。目前正在研究基于PCR的诊断方法，尽管结果令人鼓舞，但PCR需要花费数小时才能获得结果，而且费力且昂贵[11]。在远古时代，医师在获得先进的分析技术之前就严重依赖于自己的感觉。颜色，味道和气味被用来检测生物标志物[12]。已知细菌具有特征性气味。细菌菌株具有独特的新陈代谢，其中一部分导致细菌特异性挥发性有机化合物（VOC）的产生[13] – [15]。几篇优秀的综述文章[14]，[15]中已经描述了细菌的代谢途径。但是，评论尚未集中在病原体和临床问题上。使用复杂技术检测和鉴定VOC在医学中可能具有诊断价值[14]，[16]，[17]。这些技术包括气相色谱和质谱法（GC-MS），选定的离子流管质谱法（SIFT-MS）[18]，离子分子反应质谱法（IMR-MS）[19]，[20]和电子鼻子（eNoses）[16]，[21]。GC-MS用作分离，检测和鉴定VOC的金标准。SIFT-MS和IMR-MS允许实时测量某些VOC。eNoses不能识别VOC，而是依靠模式识别[16]。挥发性化合物可在体外（在培养基中或直接在患者材料中）或直接在呼出空气中（体内）进行研究，从而实现无创监测。VOC检测可以追求三个目标：（1）证明没有细菌病原体（即，非常高的敏感性和阴性预测值，因此没有开始抗生素治疗），（2）识别特定细菌菌株的存在（即，非常高的特异性和积极的预测价值，从而开始进行适当的抗微生物治疗），以及（3）分离细菌物种内的表型，从而防止引起病原体不敏感的抗生素的开始。但是，在可以在临床试验中为这些目标测试VOC之前，应该知道每个目标可能的诊断目标。因此，本综述的目的是概述脓毒症中六种最丰富和致病性细菌产生的挥发性有机化合物：金黄色葡萄球菌（SA），肺炎链球菌（SP），粪肠球菌（EF），铜绿假单胞菌（PA）），肺炎克雷伯菌（KP）和大肠杆菌（EC）[22]。
结果
- MEDLINE搜索结果根据标题和/或摘要排除了837篇文章，其中778篇被排除在外（图1）。阅读了59篇文章，并测试了纳入标准。这导致包含了27篇文章（表1）。根据参考文献阅读了10篇文章，其中包括4篇，使所包括文章的总数达到31篇。
图1 文献选择流程图
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最初的搜索结果为837次匹配。 根据标题和摘要选择了59个。 阅读全文，并检查参考文献是否有其他匹配项。 这导致了十个额外的命中。 根据全文收录了三十篇论文。
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表1 文献
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- 这些文章始于1977年至2012年，自2006年以来出版物数量迅速增加。有15篇文章报道了用GC-MS收集的数据，其中7篇报道了用SIFT-MS收集的数据，三篇报道了IMR-MS，其他六篇技术。七项研究使用了临床样本。二十项研究使用参考菌株。获得了161种代谢物的结果，其中多篇论文进行了研究。调查结果报告在文本S1中的表S1至S9中，并按功能组在下面进行了汇总。图2中显示了最突出的VOC及其与六种选定的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的（交叉）关联。
图2 交互作用图
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在两侧绘制了六个调查的病原细菌，左侧为革兰氏阳性菌，右侧为革兰氏阴性菌。图中包括了所有可以证明至少一种细菌产生令人信服的代谢物（如文本S1中的表S1至S9中的绿色单元格所示），并与所有已知可产生细菌的生产线相连特定的代谢产物。一种细菌菌株产生代谢产物的可用证据越强，代谢产物与病原体的距离就越近。突出显示了四个感兴趣的区域。中间的蓝色区域表示（几乎）总是由所有病原体产生的代谢产物，因此是具有高敏感性的候选标记，因此可能符合排除感染的要求（高阴性预测值）。三个红色区域表示仅由一种细菌菌株或主要由一种细菌产生的代谢产物。这些可能是特异于具有很高阳性预测值的病原体的挥发性生物标记。
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碳水化合物Hydrocarbons（文本S1中的表S1）
- 在文本S1的表S1中，列出了在预先指定的病原体中研究的碳氢化合物。研究最多的烃之一是异戊二烯[＃13]，尽管研究表明存在异相，但似乎在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均会产生异戊二烯[＃13]。生产最有可能通过甲基赤藓糖醇磷酸途径，是依赖生长的（对数生长期较高，而静止期较低），并且主要发生在营养丰富的环境中[23]，[24]。异戊二烯也是哺乳动物呼吸中的主要挥发物之一，不太适合作为体内研究的重点[25]。建议1-十一碳烯[＃6]和其他未被充分研究的烯烃[＃3-5]主要由PA产生，并且很可能是脂肪酸通过b-氧化途径降解的产物。建议用于大多数挥发性碳氢化合物[15]，[26]。据报道1，3-丁二烯[＃2]是由革兰氏阳性细菌产生的，而不是由革兰氏阴性细菌产生的。
醇类Alcohols（文本S1中的表S2）
- 1-醇是通过乙酰辅酶A对脂肪酸衍生物进行b-或a-氧化而产生的。乙醇[＃30]是研究最多的挥发物之一[15]。它可以由所有被调查的细菌产生，但是有些（SA，SP，KP和EC）几乎总是产生它，而另一些（EF和PA）却在顶空缺少乙醇。甲醇最明显地生产甲醇[＃32]，丙醇[＃34]，丁醇[＃27]，戊醇[＃36]和一些较长链的1-醇[＃28、29、35]，但不是唯一的。EC可能会使用这些醇类来抑制其他细菌的生长[27]。与其他病原体相比，在EC中发现支链醇异戊醇[＃25]的频率较低。这种代谢产物是通过另一种途径产生的，可能是通过异戊酰基-CoA产生的，因为当向生长培养基中添加亮氨酸时浓度会增加[28]。
酸类Acids（文本S1中的表S3）
- 脂肪酸可能是厌氧代谢的标志物，但不是菌株特异性的[29]，[30]。但是，厌氧依赖性生产不适用于非常短的挥发性脂肪酸。乙酸[＃37]最常由SA产生，但也可由其他病原体产生。异戊酸[＃42]更由SA生产。丙酸[＃44]仅在KP的顶部空间有报道。在该评价中研究的病原体的顶空还没有发现其他酸[＃38–41，45]。
醛Aldehydes（文本S1中的表S4）
- 甲醛[＃56]是由许多细菌[31]产生的，包括我们在本综述中重点关注的六种细菌。大多数病原体也产生乙醛[＃54]，但PA和KP不太可能产生这种代谢物。值得注意的是，已知乙醛和苯甲醛[＃55]具有抗菌活性[32]。甲基丙醛[＃49]，3-甲基丁醛[＃53]和2-甲基丁醛[＃48]是氨基酸的修饰形式，是形成许多酯和支链酮的中间体[15]。甲基丙醛和2-甲基丁醛主要由SA生产，而甲基丙醛由所有调查的病原体生产。
酮Ketones（文本S1中的表S5）
- 在脂肪酸衍生物的脱羧过程中产生甲基酮。最小的丙酮[＃81]是由大多数细菌产生的，但并非在所有情况下都可以产生。此外，丙酮还以高浓度存在于呼吸中，限制了其在体内作为细菌存在的生物标记物的适用性。较长的2-酮[＃62-70]是PA的经典生物标志物[28]，但汇总的结果仅提供了2-壬酮，2-十二烷酮，2-戊酮和2-庚酮的证据。SA也生产2-壬酮。乙酰丙酮或3-羟基丁酮[＃79]用于区分乳糖发酵肠杆菌科和非发酵肠杆菌科。出乎意料的是，在一项研究中，在非发酵乳油的顶空发现了乙醛。这表明其他途径都参与了乙酰丙酮的生产[33]。在南非，乙醛酸的生成与穆林素水解酶的活性，固定期的存活以及对抗生素的抗性有关[33]。
环状化合物Cyclic Compounds（文本S1中的表S6）
- 2-苯基乙醇[＃87]是最广泛的微生物VOC之一[15]，但在特此调查的病原体中却不存在。2-戊基呋喃[＃86]已被提议作为曲霉[34]，[35]的生物标记，但也发现于SP的顶空。已经提出了通过亚油酸的两种生产途径：酶促控制氧化和与活性氧的直接相互作用[34]。在这项研究中，柠檬烯[＃89]，苯酚[＃92]和甲苯[＃93]被鉴定为细菌存在的潜在标志。这可能意味着需要重新考虑先前在患者呼吸中发现这些化合物应视为外源性化合物的说法[36]。在荷兰的一项研究中，将无菌大鼠与常规大鼠进行了比较[37]。在常规大鼠中，尿中的苯乙酮[＃88]增加了13倍，表明该化合物的细菌产生。确实在一项体外研究中报道了这一点。在常规大鼠中发现了其他几种化合物，其中4-庚酮[＃76]，2-庚酮[＃66]和5-甲基-2-己烯醛是最重要的，也是由细菌在体外产生的。
酯Esters （文本S1中的表S7）
- 乙酸乙酯[＃100]和其他含乙酸酯的酯[＃99，108]是乙酸和脂肪酸之间酯化的产物。但是，产生乙酸最多的病原体（如SA）与产生乙酸乙酯最多的病原体（如EC）不同。影响该反应的因素仍然未知。丁酸乙酯可由所有六种病原体产生，但主要存在于肠球菌和EC中。
含S化合物S-Containing（文本S1中的表S8）
- 最重要的挥发性含硫有机化合物是硫化氢[＃120]，甲硫醇[＃122]，二甲硫[＃118]，二甲基二硫[＃117]和二甲基三硫化物[＃119]。所有这些都是剧毒的，可能与炎症的诱导有关[38]。所有细菌都能够产生这些化合物，但它们可能会提供有关病原体种类的其他信息。硫化氢主要由EF和EC产生，而在革兰氏阴性细菌中更常发现二甲基二硫化物。三甲基二硫可能是PA的标志物，而二甲基硫可能是PA和SP的标志物。
含氮化合物N-Containing （文本S1中的表S9）
- 最简单的含N挥发性有机化合物氨[＃142]最常由SA和PA生产。仅在假单胞菌的培养物中研究了氰化氢[＃147]，但在所有研究中均发现了氰化氢[＃147]。三甲胺[＃161]可能是PA和EC的标记。最近有人提出将2-氨基苯乙酮（2-AA）[2-130]用作PA的呼吸指示剂，并负责与PA感染相关的葡萄味[39]，[40]。但是，对文献的回顾清楚地表明，它可以由大多数细菌产生，并经常在SP和EC中发现。此外，在各种食品中都可以发现2-AA，食用后会在呼出气中发现2-AA，从而导致假阳性结果[41]。吲哚[＃148]是通过色氨酸酶将L-色氨酸脱氨基的直接产物。它主要由EC生产，但在其他病原体的顶部空间中偶尔也可检测到。色氨酸酶对于生物膜的形成是必不可少的，因此吲哚可被视为该细菌表型的生物标志物[42]，[43]。
讨论
- 致病细菌能够产生多种挥发性代谢产物。我们的系统评价确定了31篇报道败血症最重要病原体产生VOC的文章。然而，仅非常小的一部分代谢物仅由感兴趣的细菌物种之一产生。值得注意的是，一些研究未能复制先前实验的结果，从而导致总体结果相矛盾。尽管有这些局限性，但通过系统地总结现有文献，仍鉴定出了一些敏感的和一些非常特殊的候选生物标记物（图2）。
- 研究之间大量矛盾的结果可能由四个变量来解释。首先，并非所有研究都使用完全相同的细菌种亚型。在一项研究中，SA的噬菌体类型影响了顶空挥发性有机化合物[44]。亚型之间的基因组变异可能会导致特定代谢途径内酶的功效不同。但是，这些变异对于细菌种内的表型可能是有用的。但是，这可能会妨碍挥发性生物标记物在临床上用于菌株鉴定的适用性。其次，生长介质是产生的VOC的基础材料，因此是一个混杂变量[44]-[47]。第三，在细菌生长的不同时间点获得测量值。一些研究调查了这种现象，发现代谢物的消耗和生长期（对数或静止）影响顶空代谢物[48]-[51]。最后，大多数纳入的研究调查了参考菌株的培养。然而，一些研究集中在临床样本上，其中类别间的差异增加了[52] – [54]。患者样品的定义不如实验室生产的参考菌株培养物明确，并且在以下方面有所不同：CFU，生长期，宿主反应，粘度[55]，合并症和药物（例如抗生素[56]）。
- 关于生物标记物研究的第一个目标：证明不存在细菌病原体，有几种生物标记物符合临床研究的条件。异戊醇，甲醛，甲硫醇和三甲胺是由所有细菌而不是宿主产生的（图2中的蓝色区域）。乙醇和异戊二烯也是敏感的候选标记，但在哺乳动物的呼吸中大量发现。如果一项研究的目的是将细菌感染排除在鉴别诊断之外，则应研究一组易被许多病原体产生的具有较高先验机会的挥发性生物标志物。未找到任何这些候选标记可能具有较高的阴性预测值。特定菌株的鉴定可以使用以下VOC进行：SA –异戊酸和2-甲基丁醛；PA – 1-十一碳烯，2,4-二甲基-1-庚烷，2-丁酮，4-甲基喹唑啉，氰化氢和甲基硫氰化物；EC –甲醇，戊醇，乙酸乙酯和吲哚（图2中的红色区域）。尚无文献报道SP，EF和KP的候选生物标志物。为了鉴定病原体的种类，建议结合使用挥发性有机化合物。Thorn在最近的一篇论文中以及使用电子鼻技术的几项研究中说明了这种方法的优势[13]，[55]，[57]，[58]。必须按照STARD指南[59]报告诊断的准确性（敏感性和特异性），正如仅在本评价中包括的一项研究中所做的[60]。
- 病原体的表型分析应集中于感染/定殖细菌，细菌生长和细菌抗性。有趣的是，人们发现吲哚是EC中生物膜形成的生物标志物，因此可用于在同一细菌菌株中分离临床相关表型。其次，发现小的含挥发性硫化物的有机化合物可在大鼠模型中诱发炎症，因此可作为致病性的标志。第三，在培养基中添加高于MIC的水平的抗生素后，几种VOC的产生减少，这表明可以监测治疗反应。低于MIC的抗生素给药确实降低了VOC浓度，但程度较低，表明存在剂量依赖性。随附论文中未描述细菌耐药性对VOC的影响。然而，在最近的一篇关于比色电子鼻技术的论文中已朝着这个方向迈出了第一步，该技术将耐甲氧西林的SA与耐甲氧西林的SA以及耐万古霉素的EF与耐万古霉素的EF相区别[58]。
- 这篇综述有几个局限性。首先，大多数纳入研究并未涵盖所有预先选择的病原体，因此为涉及所有病原体的临床问题提供了部分证据。其次，由于大多数研究没有报告定量方法并且使用了不同的采样技术，因此每个研究中每种化合物都不能给出顶空浓度。第三，报告了顶空浓度增加，但是在某些研究中可能会漏掉浓度降低的现象。确实，不存在正常存在的代谢物可能恰好证明了病原体的存在与另一种VOC的存在。最后，使用了不同的技术来检测挥发性有机化合物。尽管并非总是使用相同的材料和分离方法，但大多使用GC-MS。但是，在牢记所用分离方法的局限性的同时，GC-MS仍是发现挥发性有机化合物的金标准。在这篇综述中，我们还包括使用SIFT-MS，IMR-MS和其他可进行化合物鉴定的技术的研究。这些技术在分离和鉴定代谢物方面不如GC-MS强大，但仍包含在本综述中，因为它们确实可以鉴定某些化合物。
- 如果挥发性有机化合物在体内用于败血症的诊断目的，则必须考虑多个因素。首先，宿主内部的生长培养基可能与体外生长培养基完全不同，从而导致产生的代谢产物不同。其次，宿主将通过发炎反应与细菌相互作用，这可能会改变新陈代谢。这种炎性反应本身可以改变人的新陈代谢，未来的研究将需要解决传染性和非传染性炎性反应之间的代谢组学差异[25]，[61]。第三，挥发性有机化合物可以来自饮食和环境。最后，即使在健康条件下，身体，包括肺部，都拥有独特的微生物组[62]，[63]。这些居住细菌很可能会产生相似的代谢产物，因此会干扰基于VOC的诊断测试。在这种情况下，被炎症改变的VOC可用于进一步区分定殖细菌和致病细菌。
- 总之，几种挥发性生物标志物被证明是无感染证明的特别有前途的候选物，而另一些则有资格检测细菌和鉴定所研究的六种细菌。但是，只能进行有限的研究。因此，应进行有针对性的研究，以鉴定潜在的挥发性生物标志物集，并评估这些标志物在危重患者中的诊断准确性。
方法
- 2012年8月1日，使用以下术语在EMBASE库中进行了广泛的系统搜索：“（质谱和光谱法）以及细菌和挥发物”。
- 如果标题和/或摘要建议对临床相关环境中的细菌病原体进行调查并测量挥发性有机化合物，则选择文章进行全文检查。
- 阅读并包括以下内容的选定文章：（a）对以下一种或多种，最常在ICU上培养的病原体进行了调查[22]：金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，粪肠球菌，铜绿假单胞菌，肺炎克雷伯菌或大肠杆菌（Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli ）和（b）提供了每种病原体检测到的挥发性有机化合物的摘要。此外，将根据标题扫描所选文章的所有参考文献，并根据先前的标准进行选择。相同数据的两次发表被忽略。根据以下分子结构（改编自以下内容），将包含的文章中描述的所有挥发性有机化合物汇总在九个表中（请参阅补充信息：表S1中的表S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9）。Hakim等人[64]）：烃，醇，酸，醛，酮，环状化合物，酯，含S和含N的化合物。它们在文本中以数字（＃）表示。如果一个分子可以包含在多个表中，则选择最合适的类别以避免重复。
- 文献中病原体产生的挥发性有机化合物（VOC）用“ +”表示，而没有分子的情况用“-”表示。结果部分着重于一项以上研究中发现的代谢产物。基于不存在或存在代谢物的证据水平，这些代谢物的行在文本S1中的表S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9中也着色。对于所有纳入的研究，根据每种病原体VOC的合并结果对细胞进行着色。透明细胞表示几乎没有证据（零或一项研究）。当有令人信服的证据表明病原体产生了VOC时，细胞将变为绿色（阳性结果多于阴性证据，且存在多个研究差异）。红细胞意味着尚不知道或很少发现病原体产生该分子（比阳性证据更阴性，研究差异更大）。矛盾的证据导致了橙色细胞。
Tables S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003311.s001