RPKM/FPKM/TPM在RNA-seq分析中的标准化流程

在RNA-seq的分析中，需要对基因或者转录本的read counts数进行标准化过程。因为落在一个基因区域内的read counts取决于基因长度和测序深度。当基因长度越长，测序深度越深，则落在该基因的read counts越多。
当进行基因差异表达的分析时，往往是在多个样本中比较不同基因的表达量，如果不进行数据标准化，比较结果则是没有意义的。
常用的三种标准化分析是RPKM (Reads Per Kilobase Million)、FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)

为了更清楚的展示计算过程，我们用三个样本的4个基因的read counts矩阵做例子（来源于YouTube）。如表1：

表1

可以清楚地看到，样本3的4个基因read counts数目明显多于其他两个样本，说明其测序深度较高，基因B的长度的基因A的两倍，也使得其read counts在三个样本中都高于A。
1、RPKM/FPKM
RPKM和FPKM的计算过程相同，都是先将测序深度标准化，再对基因长度标准化。
第一步：先将测序深度标准化，分别计算出每个样本的总reads数（为了使数值可读性更好，下面的计算中我们用10代表million），然后将表中数据分别除以总reads数即可，这样就得到了reads per million. 如下表2：

表2

第二步：基因长度的标准化。将表2的read per million直接除以基因长度即可，如表3：

表3

这里，就算出来RPKM值的结果，FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区别是FPKM适用于双端测序文库，而RPKM适用于单端测序文库。FPKM会将配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。
2、TPM
TPM的计算过程与RPKM相反，即先标准化基因长度，再标准化测序深度。仍以表1的那个例子来说明TPM是计算过程。
第一步：直接除以基因长度，得到reads per kilobase，如表4：

表4

第二步：标准化测序深度时，总的reads数要用第一步中除过基因长度的数值。即第一样本除以15，第二个样本除以20.25，第三个样本除以45.1 。表5就是TPM的结果。

表5

链接：https://www.jianshu.com/p/ffa45423e01c

补充：
因为科研过程中需要将counts值转换为FPKM值计算，所以对FPKM这一部分进行一下补充

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对数量级的理解

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要求出FPKM值，需要获得三个参数。
cDNA Fragments：为单个基因比对到基因组上的reads数，在测序数据里就是count值。HTseq处理后可以直接得到的结果。
Mapped Fragments：指每个样品中所有基因比对到基因组上的reads数。也就是用求和函数sum()将单一样品的count值全部加起来。注意，由于单位是百万，所以求和后需要除以10^6。
Transcript Length：也就是exon length，是指reads比对到基因外显子上的长度。这个需要找到参考基因组才能获得数据。