bioinfo100-第（4&5）题-illumina II&adapter

可参考
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mhw100题

第4题，illumina测序技术细节探究II

1. Illumina目前主流的测序仪都有哪几种型号？各自大概的通量是多少？（也就是1个run能跑出多少数据）

目前主流的测序仪及其通量主要是Hiseq2500（50-1000Gb）、Hiseq3000（125-750Gb）、Hiseq4000（125-1500Gb）、Hiseq X Five（900-1800Gb）和Hiseq X Ten（900-1800Gb

2. Illumina目前的测序技术，最核心的就是边合成边测序，即我们常说的 Sequencing by synthesis （SBS），那么为什么能够实现SBS？

经过桥式PCR之后同一段序列已经成簇，下一段就是开始进行测序，这一步比较简单，就是加入primer，然后添加经过特殊处理的ATCG四种碱基，特殊的地方有两点：一个是碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色，另一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，这个叠氮集团保证了每次只能够在序列上添加1个碱基.

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这样每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。如此往复，就可以测出序列的内容。

3. 我们在第1问中，问了大家一个问题“Illumina测序技术为什么不能像第1代测序技术一样测500bp以上？”，这里面主要涉及到两种错误，一种叫phasing，一种叫pre-phasing，分别是什么意思？

通俗来讲phasing表示本来同步添加的碱基有一些没加上，而pre-phasing则是加多了，都会导致当前bp的荧光检测出现噪音，造成phasing的主要原因是合成酶的活性降低，而pre-phasing则可能是叠氮基团性质不稳定，转化为羟基在一步检测中添加了不止一个碱基。
（感觉就是一旦中间有一个碱基出了问题没及时接上或者接过头了，会一直干扰后续cluster的荧光结果）
phasing，pre-phasing

今天我们提出的问题是Illumina目前常用的双端测序建库办法中，会在打断的序列前后加上adapter，请问：

第5题，测序建库adapter

1. adapter是什么意思？adapter与primer有什么区别？

adapter在中文是适配器或者接口的意思，在前面的内容中已经提到将测序序列打碎成片断后要将末端补平然后添加adapter，用于与flowcell上的oligo匹配固定并为后续桥式PCR做准备，而前面提到的Index与adapter之间的位置关系一般为adapter1-Index-fragment-adapter2，adapter2通过与oligo互补连接在flowcell上，在进行完桥式PCR之后进行测序时，添加primer，这一段primer的序列是与Index互补的而非adapter1，所以最终拿到的测序结果应该是Index+fragment+adapter2或者Index+部分fragment

2.比如最终的测序结果是 AATTCCGGATCGATCG...，那么adapter的序列可能出现在哪一端，还是两端都有可能出现？为什么？

一般出现在3’端，在上面第1题中已经说到，最终的测序结果应该是Index+fragment+adapter2或者Index+部分fragment，也就是说测序的方向是从5’到3’，adapter只可能出现在3’端。

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