科研盘点丨空间转录组技术在肝脏研究中的应用

哺乳动物的肝脏是维持代谢稳态及解毒的重要器官，单细胞 RNA 测序技术可以鉴定到大多数肝细胞类型，但如何获取细胞类型在组织上的定位及其基因表达情况，并研究细胞间相互作用及通讯对于增强我们对肝脏发育及疾病发生、发展机制的了解至关重要。

10x 空间转录组技术结合显微成像、靶向探针捕获、芯片、测序技术，从一片完整的冰冻组织切片或石蜡组织切片中获取切片不同位置细胞中转录组数据，并将组织学和基因表达分析相结合。

接下来，我们将总结一下空间转录组发表的关于肝脏的文章

案例一

单细胞结合空间组学解析胎肝造血干细胞扩增功能单元

【发表期刊】Cell Research

【影响因子】25.617

【发表时间】2021. 08

【发表单位】中国科学院动物研究所，北京大学生命科学学院

【实验技术】10x 单细胞转录组，10x 空间转录组

PART.1

研究背景

造血干细胞是血液的源头，具有强大的自我更新和多向分化能力，是恶性血液疾病移植治疗的重要细胞来源，但是，造血干细胞来源不足却是限制其推广的瓶颈。在哺乳动物的发育过程中，胎儿肝脏是各种来源的造血细胞（HCs）进行成熟、扩增和分化的场所，因此全面、系统、立体化地解析这一扩增性造血器官，将为体外扩增造血干细胞提供理论指导。

PART.2

研究思路

PART.3

主要研究结论

01、绘制了胎肝血细胞和微环境细胞发育的转录组图谱，解析了造血干/祖细胞和微环境细胞的转录组动态变化。通过对造血干/祖细胞的异质性进行深入解析，发现 CD93 可以富集干性较强的造血干/祖细胞。

02、单细胞和空间转录组联合绘制单细胞空间图谱，验证了 HSCs / MPPs 与微环境细胞间的相互作用，鉴定了干细胞扩增功能单元。

03、功能试验验证巨噬细胞和生态微环境细胞促进 HSCs / MPPs 扩增的机制。

04、跨物种分析发现人和小鼠之间具有保守的造血干/祖细胞扩增结构和机制，但也存在物种对外界刺激适应性反应特异性机制。

案例二

利用10x Visium空间转录组技术综合分析原发性肝癌空间结构

【发表期刊】SCIENCE ADVANCES

【影响因子】14.136

【发表时间】2021. 11

【发表单位】上海东方肝胆外科医院

【实验技术】10x 空间转录组

PART.1

研究背景

原发性肝癌是死亡率第二高的肿瘤,其中，肝细胞性肝癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC）是两种主要的组织学亚型。到目前为止，治疗原发性肝癌的有效非手术治疗策略还很少，而且缺乏有效的药物治疗靶点。有单细胞研究表明一些特异的 T 细胞在 HCC 中显著富集，肿瘤异质性及其在肝癌诊断中的临床意义已有多方面的研究，但是对肝癌肿瘤空间结构的研究还是空白。海军军医大学国家肝癌科学中心王红阳院士、陈磊研究员团队联合清华大学古槿教授团队利用 10X Genomics 高分辨率空间转录组技术进行了原发性肝癌边界区和肿瘤内空间异质性研究，成功绘制了原发性肝癌高分辨率空间转录组图谱。

PART.2

研究思路

PART.3

主要研究结论

01、利用空间转录组技术构建了原发性肝癌的高分辨率空间转录组图谱，原发性肝癌的组织内部细胞亚群具有区域分布和交错分布两种模式，来自相同类型区域的细胞簇总体上更相似。

02、肿瘤边缘区域微环境特征：肿瘤包膜可能影响肿瘤内空间簇的连续性、转录组多样性和免疫细胞浸润，原发性肝癌边界区域肿瘤纤维包膜的完整性与肿瘤细胞的空间异质性及其周围基质细胞和免疫细胞的分布密切相关。主要由成纤维细胞和内皮细胞组成的完整纤维包膜可以作为阻止免疫细胞浸润的屏障。

03、原发性肝癌肿瘤内部的异质性：瘤内空间异质性广泛存在。肿瘤内部不同细胞亚群具有不同优势基因表达、细胞功能、预后以及克隆来源。且肿瘤内部细胞亚群并不独立，在彼此接触的范围（100μm 宽交界区）会发生广泛的配体-受体相互作用，不同细胞簇间的相互作用可能有助于研究肿瘤生态系统和进化。

04、三级淋巴结构（TLS）的空间分布及临床特征：通过与 H&E 染色相结合分析，HCC-5 样本的 cluster6 被鉴定为 TLS 区域。选择 cluster6 中高特异性表达的前50个基因（TLS-50）作为特征基因， TLS-50 可以识别信号噪声比更高的 TLS 区域。

案例三

利用10x Visium空间转录组技术综合分析原发性肝癌空间结构

【发表期刊】Nature Communication

【影响因子】14.919

【发表时间】2021. 11

【发表单位】斯德哥尔摩大学

【实验技术】ST空间转录组技术 

PART.1

研究背景

哺乳动物的肝脏是维持代谢稳态及解毒的重要器官，肝脏中约80%的细胞都是实质细胞即肝细胞，剩余的细胞被划分为非实质细胞（NPCs），这些细胞共同组成了肝小叶功能环境。单细胞空间重建的研究中发现，肝脏中的非实质细胞也根据其位置及沿小叶轴存在着差异的基因表达谱。这些重建的方法，给出了肝小叶微环境中复杂的代谢分区，鉴定了沿小叶轴的差异表达基因，并为肝分区研究提供了丰富的数据资源。然而基于显微切割等的方法需要对组织进行解离，也从一定程度上破坏了肝脏的基因表达。作者利用 ST 技术绘制了小鼠肝脏分区基因表达模式和结构组分。

PART.2

研究思路

PART.3

主要研究结论

01、空间转录组聚类定义肝组织中的基因表达模式：组织覆盖的 spot 可聚成6个不同的 cluster，不同细胞类型的 marker 基因在所有 spot 中表达的频率与这些细胞在肝组织中的比例趋向一致。高丰度或更大的细胞在肝组织中更广泛地分布，而稀有的细胞或体积较小的细胞的分布则较为稀疏。

02、结合门静脉和中央静脉来判断基因的表达模式，建立了二元线性模型。该模型可以对基于经验的组织学注释进行补充，尤其对于难以分辨的结构成分。

03、探索了肝组织异质性的相关组分，cluster5 在整个组织切片中呈现多个区域的零星分布特征，根据其基因表达情况，cluster5 中标记基因的通路分析表明这些基因富集在胶原和纤维组织相关途径上，表明 cluster5 在空间组织上是一个独立于肝功能分区的结构。

案例四

利用10x Visium空间转录组技术综合分析原发性肝癌空间结构

【发表期刊】Cell

【影响因子】41.582

【发表时间】2022. 1.20

【发表单位】比利时根特大学等

【实验技术】单细胞 CITE-seq、单核测序、空间转录组学和空间蛋白质组学技术

PART.1

研究背景

单细胞转录组学的巨大技术进步使人们能够更好地了解跨物种不同器官的细胞组成，但了解这些细胞在组织中的基因表达信息及其与周边细胞的相互作用对于研究器官发育及疾病的发生、发展、治疗具有重要的意义。文中，作者运用单细胞核测序，单细胞测序，空间转录组和空间蛋白质组学技术等研究了小鼠和人类健康肝脏的细胞类型及特定的空间位置，确定了健康肝脏中不同肝巨噬细胞表型的保守空间相关信号。

PART.2

研究思路

PART.3

主要研究结论

01、小鼠肝脏的蛋白质基因组图谱：单核 RNA 测序（snRNA-seq）和单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）都可以检测不同的细胞组成，其中 snRNA-seq 能重现检测到的细胞频率。CITE-seq 分析，利用差异表达的基因（DEGs）和蛋白质（DEPs）确定了17种细胞类型。确定了所有细胞的表面标志物，包括 Kupffer 细胞（KCs）的 VSIG4FOLR2。

02、空间转录组结果确定了肝巨噬细胞包括 Kupffer 细胞、非 Kupffer 细胞等细胞亚群，各亚群功能各异且存在于不同的生态位中。对非 Kupffer 细胞的分析发现，cluster8 细胞簇类似于 Gpnmb+Spp1+ 脂质相关巨噬细胞（LAMs），位于胆管周围。

03、人类肝脏的巨噬细胞分为10个 cluster，cluster10 是真正的人类 Kupffer 细胞。物种间转录组的重叠可能是由于核心 Kupffer 细胞转录因子的保守表达。

04、配体受体分析结果表明进化上保守的 ALK1-BMP9/10 轴对于肝脏中 Kupffer 细胞的存在至关重要。