背景：心肌致密化不全(noncompaction of the ventricular myocardium)为一种少见但严重的先天性心脏畸形（发病率在心肌病中仅次于DCM和HCM），是由于胚胎形成过程中心肌致密化过程失败所致，其解剖学特征是心室壁过多突入心腔的肌小梁及小梁间深陷的隐窝。因其主要累及左心室，也称左室心肌致密化不全(left ventricular noncompaction，LVNC)。
临床表现主要为心力衰竭、心律失常及心内膜血栓伴体循环栓塞。目前尚无特效治疗。本病有家族遗传倾向，12%～50%的患者都有家族史，多数符合常染色体显性遗传，但少数病例符合X染色体连锁隐性遗传及线粒体遗传。
在作者此前的研究中1，发现内皮特异性敲除染色质重塑分子Ino80可以引起LVNC表型，小鼠同时出现了冠脉血管生成受损和室壁致密化不全。而特异性敲除心肌或内皮的Ino80，心室发育和致密化则不受影响。在出现了LVNC表型的Tie2Cre;Ino80fl/fl乳鼠心脏，作者观察到冠脉血管新生受损，这和在心内膜和内皮细胞中增加的E2F介导的基因转录和扩增相一致。因此作者假设当冠脉新生不能正常发生，它不能提供旁分泌或angiocrine分子来促进心肌致密化。同时，剩余的心内膜分泌促进成熟和抑制心肌增殖的分子，引起心室壁的非致密化。
在这篇文章中，作者使用单细胞测序对Tie2Cre;Ino80fl/fl和wild type乳鼠心脏进行了单细胞测序，鉴定出正常发育和LVNC时心内膜和EC表达的angiocrines。作者还在小鼠心脏和人iPSC诱导的心肌中评估了鉴定出的分泌分子对心肌细胞增殖和成熟的调节作用。
1. Altered endocardial and cardiomyocyte transcriptomes in Ino80 mutant hearts with left ventricular non-compaction
Fig 1A：作者对embryonic day E15.5的Tie2Cre;Ino80fl/+和Tie2Cre;Ino80fl/fl小鼠心脏进行了10x单细胞测序，后者展现出了LVNC表型。一共得到了518+576个细胞（10x测的细胞数这么少的？）
Fig 1B-C：聚类和注释得到9个细胞群，包括内皮 (Npr3+), 冠脉ECs (Cldn5+,Fabp4+), 平滑肌/周皮细胞 (Pdgfrb+), 心外膜 (Apela+), 3群成纤维 (Tcf21+, Col1a1+, Vcan+), 2群心室肌 (Tnni1+, Ttn+)。所有的细胞类型在两组样品中都存在。
Fig 1D：随后作者对内皮和冠脉ECs进行了重新聚类，得到3群心内膜细胞和1群冠脉内皮细胞。三群心内膜细胞中有一群(Endo 3)只在Tie2Cre;Ino80fl/fl小鼠心脏中存在。
Fig 1E, F：Endo 3高表达增殖基因如Top2a和Cdk1。
Fig 1G, H：和前面E12.5的研究相一致1，在体EDU标记和切片显示这些异位的增殖心内膜细胞在E15.5时期定位在非致密化的心肌。
Thus, this mouse model of ventricular non-compaction is coincident with the emergence of mutant-specific proliferative endocardial cells embedded within non-compacted myocardium.
Fig 2A：由于心内膜/内皮Ino80敲除的表型主要在心肌，所以作者随后对心肌进行了重新聚类，得到3个群。
Fig 2B, C：作者期望不同的心肌亚群可以代表不同的致密的和非致密的心肌。但是发现根据已知的致密和小梁marker不能很好的区分。细胞主要是根据成熟度和增殖区分开的。
成熟心肌marker：Ttn, Myh7, mt-Co1
immature myocardium：Tnni1
cycling：Aurka, Cdk1
Fig 2D：对两组小鼠心肌细胞进行差异分析，Ino80 缺陷小鼠的心肌细胞有39个基因下调，13个上调。富集分析结果显示糖酵解，脂肪酸代谢等通路在Ino80 缺陷小鼠的心肌细胞中被富集到，而与myogenesis相关的通路则出现下调。
Fig 2E, F：E图展示了一些与前面通路有关的基因，F图使用in situ hybridization验证了一下Nppa的表达。
2. Left ventricular non-compaction-associated genes are expressed in multiple cardiac cell types
Fig 3A：作者观察到Tie2Cre;Ino80fl/fl小鼠心脏存在血管细胞的先天缺陷，可以引起小鼠心室致密化不全。为了确定这个现象在人类中可能也存在，作者首先检测了LVNC患者中存在变异的基因在对照小鼠中的表达。有趣的是，接近半数基因特异性的在不成熟的CM1群表达，一些基因则在成熟的CM2群表达更高。还有1/3并不在心肌表达，而是在基质细胞中表达，比如内皮，冠脉内皮，壁细胞和成纤维。
为了进一步研究这些发现和临床患者的相关性，作者对一个22周的胎儿心脏进行了单细胞测序。
Fig 3B：在Fig 3A中查看的基因在人类心脏中也存在着类似的表达模式。
Fig 3C：在另外一个成人心脏数据集中，这些基因也存在着类似的表达模式。
Fig 3D：随后作者探究了这些基因是否在Tie2Cre;Ino80fl/+和Tie2Cre;Ino80fl/fl小鼠心脏中存在差异。在这些基因中，有7个基因至少在一个细胞类型中存在差异表达。
These data indicate the possibility that LVNC-associated genes are derived from cells other than cardiomyocytes in humans and that they may be important for cardiac homeostasis and function in the adult.
3. Col15a1 is expressed in coronary ECs and stimulates cardiomyocyte proliferation
作者此前的研究显示，内皮细胞刺激心肌细胞增殖这一对心室致密化至关重要的过程并不依赖于血流，而且是Ino80依赖的。因此作者假设这个活动是被冠脉内皮特异性分泌的分子介导的，而且这个分子在Ino80突变后会出现下降。因此作者在单细胞数据中筛选了1. 冠脉内皮表达; 2. 心内膜不表达; 3. 编码分泌蛋白 的基因，得到15个候选基因。
Fig 4A：在候选基因中，作者发现Col15a1在正常小鼠冠脉内皮、平滑肌和成纤维细胞表达，在人的冠脉内皮和成纤维表达。
Fig 4A-C：但是在Ino80缺陷冠脉EC中，Col15a1的表达显著下降。（其他细胞类型没有出现明显下降）
Fig 4D：E15.5小鼠心脏的原位杂交也证实了前面的结论。
These data indicate that endothelial deletion of Ino80 impairs expression of Col15a1 in coronary vessels, which may play a role in ventricular non-compaction.
随后作者通过小鼠心脏组织块培养探究了重组Col15a1对心肌增殖的作用。
Fig 4E：E12.5小鼠心脏组织块被置于盘子上培养了1天，随后给予重组蛋白或vehicle control 36h，然后进行检测。
这样做组织块培养真的没问题吗？？？师姐说
Fig 4F, G：作者用磷酸化组蛋白H3 (phospho-H3) 和EDU检测细胞增殖情况，发现给予外源重组Col15a1刺激的正常心肌细胞出现了增殖增加。
Fig 4H：在心肌增殖下降的Ino80 cKO小鼠，给予Col15a1刺激之后，心肌细胞增殖出现增加。
Fig 4I：给予Vegfr抑制剂s100a5抑制心肌增殖，给予Col15a1刺激之后，心肌细胞增殖也恢复。
Fig 4J：在作者此前的研究中，LVNC患者iPSC诱导的心肌出现降低的增殖潜能。为了探究Col15a1是否能促进人类心肌细胞增殖，作者对LVNC iPSC-CMs使用了Col15a1刺激，发现给予了Col15a1刺激的LVNC iPSC-CMs增殖能力与正常的iPSC-CMs接近。
这些结果显示，冠脉血管来源的Col15a1可以促进心肌增殖，Col15a1在Ino80缺陷的乳鼠中下降，可能参与了非致密性心肌病表型。
4. Defective endocardium expresses secreted factors that inhibit cardiomyocyte proliferation and stimulate maturation
在Fig1D中，作者在LVNC中鉴定出了一群mutant-specific内皮细胞群，因此作者推测这群细胞可能在心肌致密化过程中分泌一些分子影响周围心肌。
Fig 5A：作者计算了Ino80缺陷鼠心脏中在这群mutant-specific EC的上调基因，找到了Tgfbi, Igfbp3, Isg15和Adm。但是这些基因都不是mutant-specific EC特异性表达的。在这几个基因中，作者最关注Tgfbi，因为在他们此前的研究中，人LVNC iPSC-CMs出现了异常的TGF-b信号。
Fig 5B-D：验证这几个基因的高表达。
Thus, these genes constitute a list of secreted factors whose expression is positively correlated with ventricular non-compaction in mice.
随后作者想要知道这些基因表达改变是Ino80敲除的直接后果还是受损的冠脉新生和心室非致密化（如缺氧）的组织水平反应。
Fig 6A：作者对单细胞数据中的内皮Endo和冠脉内皮CV，Tie2Cre;Ino80fl/fl心脏E13.5和E14.5（尚未出现严重致密化异常表型）的bulk RNAseq数据，转染了Ino80-specific siRNA的人脐静脉内皮(HUVECs)的bulk RNAseq数据进行了整合分析，发现Tgfbi和Isg15在Ino80敲除的HUVECs和Tie2Cre;Ino80fl/fl心脏中出现上调。这个现象提示Isg15和Tgfbi可以直接受Ino80调控，而Igfbp3和Adm的上调可能是组织缺氧的结果（在别的文献中也有报道，这些基因属于hypoxia-inducible genes）
随后作者想要使用小鼠和人的心肌细胞去验证Ino80缺陷的心内膜和冠脉内皮细胞上调分泌因子抑制心肌致密化这个假说。作者给予心肌细胞的刺激包括单独给予上面鉴定出来的四种分子 (Tgfbi, gfbp3, Isg15, or Adm) 或四个一起给 (4 factors or ‘4F’)。采取的方法还是前面Fig 4E的方法。
Fig 6B：Phospho-H3免疫染色提示Tgfbi和Isg15降低了心肌细胞增殖。
Fig 6C：EDU的结果提示单给这四种因子或一起给都可以降低心肌增殖。
Fig 6D：给iPSC-CMs四种因子或一起给也可以抑制细胞增殖。
Fig 6E-G：作者还发现了与非致密化相关的结构变化。组织块培养的心肌细胞在给予了四种因子/4F刺激之后，致密化程度要高于control。
Fig 6H：另外一个心肌非致密化的结构变化是premature cardiomyocyte maturation. 在更早的发育阶段，Ino80 mutant的心肌展示出更有组织的肌节结构。免疫荧光显示4F和Tgfbi treated iPSC-CMs将心肌细胞从环形的形态转变为了更有规则的肌节，心肌成熟变得正常。Thus, secreted factors whose expression was increased in Ino80-deficient endocardial and ECs sup- press cardiomyocyte proliferation, a hallmark feature of ventricular non-compaction.
Fig 6I-K：心肌细胞成熟的另一个特征是电生理特性的改变。膜片钳结果显示和control相比，4F干预增加了最大上升速率和动作电位幅度。此外，给予干预的细胞的静息电位从-60变到了-70mV，提示IK1 channel的电流增加。这些结果提示电生理成熟的增强。
Taken together, these data show that, in culture, endocardial-derived factors overexpressed in Ino80-mutant ECs can drive the structural phenotypes seen in non-compacted hearts.
5. General inhibition of coronary angiogenesis recapitulates non-compaction
前面的结果显示冠脉血管表达分泌因子刺激心肌增殖，提示冠脉血管生成可以引起非致密化，而这个过程并不依赖于Ino80。
Fig 7A：为了验证这个假说，作者使用不同的抑制冠脉血管生成的基因鼠，分析了心室壁的发育。AplnCreER被用于在E12.5和E13.5时间点清除VEGFR2，并在E16.5时对小鼠进行了采样和检测。
AplnCreER is specific to coronary ECs in the developing heart and VEGFR2 is required for general EC growth, allowing us to specifically inhibit coronary angiogenesis without affecting the endocardium.
Fig 7B, C：在E16.5检测小鼠心肌小梁和致密心肌宽度显示出compact expansion的缺陷和over-developed trabeculae。
因此，作者认为general coronary vessel inhibition can lead to non-compaction in mice.
6. Adult phenotype of embryos exhibiting non-compaction
随后作者想要去探究是否在Tie2Cre;Ino80fl/fl小鼠胚胎心脏上观测到的明显表型在adult中也存在。因此作者将小鼠养殖到成年，观测了心脏室壁形态和心脏功能。
Fig 8A：作者首先观测到了Tie2Cre;Ino80fl/fl的致死现象，因此没有足够多的小鼠活到成年。这种致死现象可能是由于严重的心室非致密化。但由于这是一个pan-endothelial Cre，所以不能排除其他血管床和血细胞的影响。因此作者选择了更加特异性的Cre：Nfatc1Cre（specific to endocardial cells in the heart）。Nfatc1Cre;Ino80fl/fl小鼠死亡率相对较低。随后作者对存活小鼠心脏进行了检测。
Fig 8B：HE结果显示Nfatc1Cre;Ino80fl/fl小鼠心脏并没有广泛的小梁形成，但是几乎所有的心脏都要比Nfatc1Cre;Ino80fl/+小鼠心脏大。
Fig 8C, D：超声心动图的结果显示心脏收缩功能明显受损，左室射血分数降低，舒张末期容积下降，左室mass增加。和B图的组织学发现相一致。
这些结果显示敲除心内膜和(部分)冠脉EC的Ino80，会引起轻微的胚胎心室致密不全，进一步引起成年心脏的功能异常。
总结：
参考文献：
- Rhee S, Chung JI, King DA, D’amato G, Paik DT, Duan A, Chang A, Nagelberg D, Sharma B, Jeong Y, Diehn M, Wu JC, Morrison AJ, Red-Horse K. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nat Commun 2018;9:368.