众所周知，逆转录产生RNA的互补DNA (cDNA) ，而cDNA可作为RNA研究中一系列下游应用的模板。因此，发现并避免cDNA合成过程中的潜在问题，对于保证实验结果的有效性至关重要。
今天的#你问我答#我们就整理了一些适用于绝大多数常见的逆转录应用的小现象和其可能原因，并加入了改良方法，现在一起来看看吧～
碰到问题：RT-(q)PCR扩增量低或未扩增
可能原因：RNA完整性低
改善建议：
• 合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。
• 尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。
• 遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。
• 在建立逆转录反应时加入RNase抑制剂。
• 使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保无RNase。
• 将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。
• 在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。
• 考虑使用对已降解的RNA样品高度有效的逆转录酶。
可能原因：RNA纯度低
改善建议：
• 遵循特定来源（组织、血液和植物）样品RNA纯化方案。
• 通过UV光谱法，读取一定波长范围的吸光度，评估RNA的纯度。
• 检查RNA提取步骤。避免超过源材料推荐的用量，使样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去杂质和抑制剂。
• 如有必要，在无核酸酶水中稀释起始RNA，以降低潜在的抑制剂浓度。
• 如有必要，重新纯化RNA样品，以除去残留的盐和抑制剂。考虑使用耐受盐、残留生物抑制剂和提取试剂的抑制效应的逆转录酶。
可能原因：GC含量高及/或二级结构
改善建议：
• 在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
• 通过在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录以最小化发夹序列形成的可能。
• 使用能够承受高反应温度的热稳定逆转录酶。
可能原因：低RNA量
改善建议：
• 检查起始RNA的推荐用量方案。通过紫外光谱确定RNA量。为获得更高精度和特异性，可考虑选择基于荧光定量的方法。
• 在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性影响最小的基因组DNA去除方案。
• 使用高效率、高灵敏度的逆转录酶，以逆转录低丰度RNA。
• 选择在宽的起始RNA量范围内可获得高度线性的逆转录试剂，以确保可以准确定量低丰度RNA。
可能原因：不理想的逆转录酶
改善建议：
• 为了提高cDNA的得率，选择具有更高灵敏度、持续合成能力、和耐受抑制剂的高效逆转录酶。高效逆转录酶非常适合于具有挑战性的RNA样品，如已降解或含抑制剂的样品。
• 对于较短反应时间和较高反应温度的实验，分别使用具有高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。
可能原因：逆转录未达到理想时间和温度
改善建议：
• 确保反应时间和温度适合于所选的逆转录酶。
可能原因：不正确的引物设计
改善建议：
• 针对特定的RNA模板，查看关于逆转录引物类型的建议。例如对于细菌RNA或缺乏poly(A)尾的RNA，以及可能降解的RNA，使用随机引物代替寡核苷酸（dT）引物。对于基因特异性的引物，确保引物的序列与靶序列的3' 端互补。
• 反应组分的质量（或稳定性）
• 遵循制造商的建议存储和使用试剂。
• 确保使用的试剂为新鲜配制，并适于所选择的逆转录酶。
• 混合试剂能完全溶解可能已经沉淀的DTT和盐。
碰到问题：RT-(q)PCR非特异性扩增
可能原因：基因组DNA (gDNA)污染
改善建议：
• 通过PCR检查gDNA污染，使用没有逆转录酶的对照反应（减量RT或无RT对照）。
• 在逆转录前用DNA酶处理RNA样本。在灭活/去除所选DNA酶的过程中考虑能尽可能降低RNA非特异性降解的gDNA去除步骤。
可能原因：有问题的引物设计
改善建议：
• 如果使用基因特异性引物，回顾引物设计的建议。验证引物的结合位点针对于目的基因的特异性。
• 在较高的温度下进行逆转录，以帮助提高引物结合的特异性，并使用热稳定逆转录酶。
• 在构建(q)PCR时，选择跨越外显子-外显子接点的PCR引物，以使cDNA特异性扩增。
碰到问题：cDNA截短
可能原因：RNA完整性低
改善建议：
• 合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。
• 尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。
• 遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。
• 在构建逆转录反应时加入RNase抑制剂。
• 使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保去除RNase。
• 将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。
• 在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。
• 可考虑能在已降解的RNA样品中高效工作的逆转录酶
可能原因：存在逆转录酶抑制剂
改善建议：
• 遵循针对特定来 源的RNA纯化方案 ，比如组织、血液和植物。
• 通过UV光谱法，读取跨越一定范围的波长的吸光度来评估RNA的纯度。
• 检查RNA提取步骤。避免加入超过源材料的推荐用量，使得样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去抑制剂。
• 如有必要，重新纯化RNA样本以去除残留的盐和抑制剂。
• 如有必要，在无核酸酶水中稀释起始RNA，以降低潜在的抑制剂的浓度。
• 对于盐、残留的生物抑制剂和提取试剂引起的抑制效应，可考虑使用具有耐受作用的逆转录酶。
可能原因：高GC含量及/或二级结构
改善建议：
• 在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
• 通过在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录，最大限度降低发夹序列形成的可能。
• 使用能够承受高反应温度的高热稳定性逆转录酶。
可能原因：有问题的引物
改善建议：
• 如果使用基因特异性引物，验证引物的结合位点靶向目的基因的唯一性。
• 尽可能使用寡核苷酸（dT）引物进行全长cDNA的合成。
• 对于可能降解的RNA，为了进行最有效的逆转录，可考虑随机引物。
• 当使用随机引物时，优化引物浓度以获得长cDNA片段，同时保持高得率。
可能原因：不理想的逆转录酶
改善建议：
• 选择能够合成长cDNA的逆转录酶。这种类型的逆转录酶常表现出低RNase H活性、增强的持续合成能力以及对抑制剂的高耐受性。
碰到问题：cDNA pool代表性差（低覆盖率）
可能原因：RNA丰度低
改善建议：
• 使用能以最小偏差减少多余的RNA（比如核糖体RNA）并富集目的RNA（比如poly(A)尾RNA ）的RNA分离方法。
可能原因：RNA完整性低
改善建议：
• 合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。
• 尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。
• 遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。
• 在构建逆转录反应时加入RNase抑制剂。
• 使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保去除RNase。
• 将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。
• 在灭活/去除所使用的DNas的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。
• 考虑能高效处理已降解RNA样品的逆转录酶
可能原因：RNA纯度低
改善建议：
• 遵循针对特定来源（如组织、血液和植物）样品RNA的纯化方案 。
• 通过UV光谱法读取一定波长范围的吸光度，评估RNA的纯度。
• 检查RNA提取步骤。避免超过源材料的推荐的用量，使得样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去杂质和抑制剂。
• 如有必要，重新纯化RNA样品，以除去残留的盐和抑制剂。
• 考虑使用可耐受盐、残留的生物抑制剂和提取试剂引起的抑制效应的逆转录酶。
可能原因：高GC含量及/或二级结构
改善建议：
• 在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
• 在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录，最大限度减少发夹序列形成的可能。
• 使用能够承受高反应温度的热稳定逆转录酶。
可能原因：引物有问题
改善建议：
• 优化引物混合物和浓度（例如，寡聚（dT）和随机六聚体），以减少偏差和增加对不同靶序列的检测效果。
• 对于可能降解的RNA，选择随机引物以确保适当的覆盖率。
可能原因：逆转录未达到理想时间和温度
改善建议：
• 根据所选择的逆转录酶优化反应时间和温度。
可能原因：不理想的逆转录酶
改善建议：
• 选择具有更高灵敏度、持续合成能力和热稳定性的高效逆转录酶。这些酶的性能可以检测低丰度的RNA、长链转录物、已降解样品及含有抑制剂的模板。
• 对于较短反应时间和较高反应温度，分别使用具有高持续合成能力和改善热稳定性的逆转录酶。
碰到问题：cDNA序列错误
可能原因：不理想的逆转录酶
改善建议：
• 检查所用的逆转录酶的错误率或保真度。此外，通过高质量的读长、配对末端测序及样本重复验证测序结果的可靠性。
可能原因：基因组DNA污染(gDNA)
改善建议：
• 采用没有逆转录酶的对照反应（减少RT或无RT对照），通过PCR检查gDNA污染。
• 在逆转录前用DNase处理RNA样本。在灭活/去除所选DNase ，可考虑能可最大限度减少RNA非特异性降解的gDNA去除步骤。
• 如果PCR扩增的cDNA已测序，选择跨越外显子-外显子接点的PCR引物，以使cDNA特异性扩增。
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