CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后

简单整理一下：
protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（一）https://www.jianshu.com/p/bfb34ba1050d
protocol-使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑（二）https://www.jianshu.com/p/fb693b81748b

因为没看懂又中途跑去看了一波中文
CRISPR-Cas9学习笔记 https://www.jianshu.com/p/b9d2a7203e6c

差不多的时候，在师兄带领下，学习设计了一下sgRNA（讲真，这部分我真是什么都不懂，全靠师兄演示之后再自行补充背景知识）
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 https://www.jianshu.com/p/8222f449cb44

此外，还有穿插学习的内容
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记 https://www.jianshu.com/p/ccae8b289cab
FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing https://www.jianshu.com/p/a70e7c2b83d0

设计了sgRNA之后怎么办呢？？还是这篇文章

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先讲一下这里的框架

（1）首先是实验设计

Experimental design
1. Target selection for sgRNA--选择靶点
2. Approaches for sgRNA construction and delivery. sgRNA的释放方式
3. Design of repair template. 设计修复模板
4. Clonal isolation of cell lines.分离目的细胞
5. Functional testing.功能验证

（1）Experimental design

1. Target selection for sgRNA--选择靶点

详情见：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 https://www.jianshu.com/p/8222f449cb44

2. Approaches for sgRNA construction and delivery.

sgRNA的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的sgRNA的表达质粒。

A）PCR扩增的方法
U6：来源于人U6小核启动子，常用小RNA 表达，转录本为shRNA。
将sgRNA放到U6后面，利用U6的启动来扩增sgRNA。
将这部分内容整合到Cas9 expression plasmid pSpCas9（Cas9表达质粒）中，一起共转。

优点： This method is optimal for rapid screening of multiple candidate sgRNAs, as cell transfections for functional testing can be performed shortly after obtaining the sgRNA-encoding primers. Because this simple method obviates the need for plasmid-based cloning and sequence verification, it is well suited for testing or co-transfecting a large number of sgRNAs for generating large knockout libraries or other scale-sensitive applications. 快速、简便、研究多。

B）sgRNA表达质粒的方法
现在我要用这个方法来举例

优点：Construction of an expression plasmid for sgRNA is also simple and rapid, involving a single cloning step with a pair of partially complementary oligonucleotides. B方法一样高效快捷
介绍一下这些质粒：
（1）The oligo pairs encoding the 20-nt guide sequences are annealed and ligated into a plasmid (pSpCas9(BB))：包含可插入sgRNA target序列位点的Cas9的质粒，这个质粒叫做pSpCas9(BB
（2）Cas9 alone (pSpCas9)：只有Cas9的质粒
（3）包含筛选标记的质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP and pSpCas9(BB)-2A-Puro
（4）有用于Cas9 HDR及DSB的D10A nickase mutant （D10A切口酶突变）的质粒：pSpCas9n(BB)-2A-GFP，pSpCas9n(BB)-2A-Puro)

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(b) Schematic for co-transfection of the Cas9 expression plasmid (pSpCas9) and a PCR-amplified U6-driven sgRNA expression cassette.
(c) Schematic for scarless cloning of the guide sequence oligos into a plasmid containing Cas9 and the sgRNA scaffold (pSpCas9(BB)).

设计p53引物

找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列（2000 bp）

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找到的序列如下：

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将上面复制的序列粘贴到blast中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

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系统反馈说我提交的序列和数据中的某基因很像，问我是不是就用下面这个。

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选和不选我都试过了，选择的话，得到的引物有两对，如下（摘选了其中一个）：

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如果不选的话

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摘选一个引物：发现两种都可以得到比较好的引物，但是后者的引物有不少错配，前者的引物质量看起来更好（而且可以看到primer几乎是均匀的横跨1 kb大小，说明map到target上很好，后续验证knockout的时候也会好做）。

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3. Design of repair template. 设计修复模板

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这几个词不知道要看多少遍，我承认，我不止一次看到它，但是我每次都无法精确理解其中的含义

error-prone NHEJ pathway
都说修复方式有两种
（1）NHEJ：nonhomologous end joining，非同源末端结合，这个方式在没有修复模板的情况下发生的。
（2）HDR：homology-directed repair，同源直接修复。这个方式是在有修复模板的情况下。
修复模板：（1）plasmid-based donor repair templates that contain homology arms flanking the site of alteration，也就是有一个供体质粒，质粒有两端同源序列（互补DSB用），两段同源序列之间就是我们要插入或者修改的内容。同源臂通常大于500 bp（2）single-stranded DNA oligonucleotides (ssODNs)，emm。。。就是需要两条单链寡核苷酸（ssODN），两臂也是带有同源序列（30~60个碱基，但为了提高效率，最好是大于40个），在Cas9切开双链之后，模板的两臂同源序列直接互补（HDR，同源修复），从而完成了基因编辑。聪不聪明！
上传一张自己的理解图

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4. Clonal isolation of cell lines将已编辑的细胞分离开来

这个很好理解，在编辑片段中加入抗生素抗性基因或者荧光基因后，可通过抗生素筛选或者FACS分离。

5. Functional testing功能验证

In cells co-transfected with a pair of sgRNAs to mediate a genomic (micro)deletion or inversion, indel mutations can be detected either by the SURVEYOR nuclease assay or by sequencing. Our online CRISPR Design Tool provides recommended primers for both approaches. 好了，那么大概的意思就是，咱们想办法检测到indel mutation，也就是检测我们动过的地方，可以使用surveyor核酸酶实验，也可以使用测序（当然这样更好啦）

（1）SURVEYOR nuclease assay

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（2）Detection of indels or HDR by sequencing.

测序啦！

感谢师兄DZ