P.297 传染病病原1~8

细菌

一、鼠疫耶尔森菌--肠杆菌科、耶尔森菌族、耶尔森菌属。1_{2μm长、0.5}0.7μm宽，短小杆菌。G-，（美兰染色）两极浓染。

☆单一环状染色体，3种质粒。

1. 采取标本
   服药之前，依体征取材，所有病人都要采血。并根据疾病部位取样。

• 动物腐败材料→骨髓&脑组织
• 昆虫材料--蚤类

无菌平皿，低温存运。

2. 病原分离
   经典“四步检验”。
   显微镜（近年很少用）：☆美兰染色--两极浓染的短小杆菌
   培养基分离鼠疫菌--1%溶血的胰酶消化肉琼脂（赫氏琼脂），腐败材料：培养基加甲紫、胆酸钠，抑制杂菌。
   接种，脏器标本剪刀剪出断面，在琼脂表面压印，然后涂开。
   28℃孵育

• 24 h后，肉眼隐约可见、细碎玻璃渣样菌落

• 48 h后，直径不到2mm、灰白色中央突起菌落

显微镜下

• 菌落带暗黄的灰色，表面有粗糙的颗粒样突起
• 加血的培养基上，有☆花边状☆，薄而透明不整齐的边缘

挑取菌落做噬菌体裂解试验。
注射小鼠、豚鼠腹腔，肝脏匀浆“盲传”下一只

3. 病原鉴定--噬菌体裂解试验阳性
   平板涂开，诊断用鼠疫噬菌体，自然流下。28℃、24 h→宽于流痕透明噬菌带，模糊扩展边缘。
   经典“四步检验”中，最后接种小鼠or豚鼠确定毒力，目前一般不做。
4. 快速检测方法

• PCR：特异性基因--fra、pla、inv、hms
• 免疫检测： F1 抗原

1份标本同时检出2种特异基因和特异抗原可判定，判定时间72 h缩短到3 h。

5. 抗体检测
   针对F1抗原的抗体，用于回顾诊断、动物间流行及强度检测

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二、霍乱

菌体抗原(O抗原)不同的血清群，O1群、O139群霍乱弧菌为病原菌，弧菌属。表现为腹泻、呕吐。繁殖速度最快细菌之一。
O1群分为古典生物型、埃尔托生物型El Tor型。2个生物型血清分型相同：小川型、稻叶型、彦岛型
两个环状染色体，染色体1、染色体2。大部分生长生存和致病基因在染色体1上。

1. 采取标本
   所有病人都要采粪便，根据流调，可疑食物、水。
2. 病原分离
   直接分离：水样便直接→TCBS/庆大霉素选择平板。
   增菌后分离：食品、水→碱性蛋白胨水（增菌）→TCBS/庆大霉素选择平板。
   兼性厌氧菌，16~42℃生长，pH 6.0~9.2。培养温度37℃，适宜pH 7.2~7.4
   ☆钠离子刺激生长，＞8%NaCl不生长。
   ☆O1群、O139群霍乱弧菌是繁殖速度最快细菌之一，AP中最初数小时生长超过大肠杆菌。
3. 病原鉴定
   G-短小稍弯曲杆菌。1.5_{2.0μm，宽0.3}0.4μm。有一根鞭毛。
   O139群有比较薄的荚膜（K抗原）。
   测O抗原：玻片凝集、ELISA。挑取菌落与诊断血清做玻片凝集实验。玻片凝集用血清的效价应为☆1:40~1:50。菌落在血清旁磨匀，很快＜10秒，明显凝集者+。生理盐水对照。
4. 深入鉴定
   流行株/非流行株 判别 噬菌体——生物分型方法。

• 噬菌体（VP1~VP5）将“埃尔托型”分成32个噬菌体型。
• 菌株的①溶原性、②对溶原噬菌体的敏感性、③山梨醇发酵试验、④溶血试验，4个生物学性状，将“埃尔托型”分成a~l共12个生物型。

流行株：噬菌体1_{6型、生物型a}f。剩下的非流行株。7_32、gl。
常见：噬菌体1_{3型、生物型a}d。
最常见：1a、1b、1d。
PCR鉴定→产毒基因--ct基因。流行菌株常带有霍乱肠毒素。

5. 免疫检测
   肠道非侵袭性细菌。主要 IgA抗体，抗毒（大量毒素刺激）&抗菌（细菌脂多糖）抗体
   常用：GM1-ELISA、杀弧菌抗体试验。

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三、伤寒与副伤寒--乙类、带菌数年，常温、室温；肥达试验-辅助诊断

伤寒与副伤寒沙门菌，乙类传染病
G-杆菌，有鞭毛，多数有菌毛。
新分离伤寒、某些丙型副伤寒菌体外有荚膜多糖。
兼性厌氧，10~42℃生长，37℃最适；适宜pH 6.8~7.8
传染源：患者、带菌者（从事食品加工）。 ☆可带菌数年

1. 采取标本

• 血标本，（病程第1~2周采集），发热未退、2周后仍可阳性。静脉血立即接种室温平衡＞20℃血培养瓶，室温条件下运送或、不超过2 h。培养瓶放在室温
  全病程可采骨髓，特别适用已抗生素治疗的疑似病人，提高检出率。
• 粪便采集、（病程第3~4周）、抗生素前or停药3天后。
  水样&食品样。带菌者以粪便检测为主。
• 其他标本（公厕粪便，苍蝇10~15个一组），10~20 ml SF增菌管，常温运送

2. 病原分离
3. 血标本：1:10→加入血液需氧培养瓶/胆盐葡萄糖肉汤培养瓶，36±1℃，分别于1d、2d、7d转种血琼脂平板/营养琼脂平板。
4. 骨髓：2滴骨髓液→直接滴入血琼脂平板/营养琼脂平板18~24 h，转种同样平板24~48 h
5. 粪便：直接接种到“MaC麦康凯/DHL、SS琼脂平板”，或10 ml SF增菌后再接种该选择性培养基18~24 h，→继续24 h，判阴。
6. 食品：按国标
7. 水&其他外环境样：标本增菌管/瓶，36±1℃，18~24 h→接种选择性培养基 36±1℃，18~24 h，→继续24 h，判阴。
   本菌在5种平板上“中等大小、无色半透明、表面光滑、菌落边缘整齐”菌落，血平板上无溶血环（血琼脂平板、营养琼脂平板、MaC、DHL、SS琼脂平板）。产H2S菌株中心黑褐色菌落（DHL、SS、XLD琼脂平板）
8. 病原鉴定
9. 初步生化鉴定
   分别接种克氏双糖铁（KIA）斜面or三糖铁（TSI）斜面和动力-靛基质-尿素（MIU）半固体→观察生化反应
   不发酵乳糖、蔗糖，发酵葡萄糖、麦芽糖，甘露醇。
   伤寒沙门菌不产气，甲乙丙副伤寒沙门菌产气。吲哚、尿素、V-P试验均阴性，产生H2S。
10. 血清型分型：先用A~F群沙门菌“O”多价血清作玻片凝集，若凝集再用O2、O4、O7、O9因子血清做凝集。
11. 抗体检测
    肥达试验(试管凝集反应)--辅助诊断。
    伤寒沙门菌：O凝集价(IgM-O)＞1:80、H凝集价(IgM-H)＞1:160
    甲乙副伤寒沙门菌：H凝集价＞1:160
    方有辅助诊断意义。

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四、淋病病原--巧克力血琼脂平板orT-M培养基、5% CO2、35~36℃、多粘菌素B & 万古霉素

淋病双球菌，奈瑟菌属(脑膜炎奈瑟菌也是双球形)。G-，革兰染色_{粉红色；**美兰染色}蓝色**
潮湿、35_{36℃、**2.5%}5% CO2 环境**
完全干燥存活1~2 h，微湿衣物 18~24 h；1:4000硝酸银 7 mins，1%石炭酸（苯酚） 3 mins死亡

1. 采取标本
   棉拭子、泌尿生殖道分泌物or子宫颈口分泌物。
   保暖保湿、立即送检。
2. 镜检

• 分泌物涂片、革兰染色镜检。中性粒细胞内发现G-“双球菌”，有诊断价值。
• 女性杂菌多，WHO推荐培养法检查女病人。
• 慢性淋病患者取前列腺按摩液。
• 咽部涂片发现G-双球菌，不能诊断；其他奈瑟菌属在咽部是正常菌群。

3. 病原分离
   接种“预先加温的巧克力血琼脂平板”or“T-M培养基”，可加入多粘菌素B & 万古霉素，抑制杂菌。35~36℃，5% CO2, 36~48 h，镜下G-双球菌，即可诊断。
4. 病原鉴定
   确证：氧化酶试验、糖发酵试验、直接免疫荧光试验。

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五、梅毒病原

梅毒螺旋体，G-，但不易着色。抵抗力极弱，各种敏感(氧、热、pH、脱水)

1. 采取标本

• Ⅰ期梅毒→硬下疳渗出液；确保观察密螺旋体运动、尽快检查＜20 mins
• Ⅱ期梅毒→梅毒疹渗出液/局部淋巴结抽出液
• 先天梅毒→脐血标本/母亲血清；神经梅毒→脑脊液测抗体。

脐血的梅毒抗体效价明显高于母体时，疑婴儿感染

2. 镜检

• 新鲜标本--暗视野显微镜下检查
• 与荧光标记的梅毒螺旋体抗体结合--荧光显微镜下观察/ELISA法--光学显微镜检查
• Fontana镀银染色法--棕褐色，光镜下易见

3. 病原分离

• 接种→兔睾丸or眼前房内繁殖
• 1.5%O2氧浓度、含棉尾兔上皮细胞的组织培养基、34_{35℃、分裂时间30}33 h

4. 抗体检测
   除特异性抗体外，还产生反应素抗体

梅毒螺旋体表面脂质
宿主细胞释放的脂质 引起

对应非密螺旋体抗原试验&密螺旋体抗原试验2种

1. 非密螺旋体抗原试验
   正常牛心肌的心脂质作抗原→测反应素（抗脂质抗体）--用于初筛和疗效观察

- VDRL试验：**胆固醇**为载体，包被**心脂质**，构成**VDRL抗原微粒**。玻片上进行，需低倍镜观察
- RPR试验：VDRL试验的改良，活性炭颗粒吸附**VDRL抗原**，肉眼识别。

2. 密螺旋体抗原试验
   测螺旋体特异抗体（梅毒证实试验），Nichols株螺旋体为抗原
   其中FTA-ABS诊断金标准（间接荧光抗体检测方法）
   Reiter螺旋体、吸去血清中螺旋体杂抗体→滴加到吸附有Nichols株螺旋体的玻片反应圈→加入异硫氰酸荧光素标记的抗人IgG（FITC-抗人IgG）。若血清中有密螺旋体抗体，荧光显微镜下可见发荧光的Nichols螺旋体。
   仍不能区分雅司、品他病和地方性梅毒。有假阳性，需结合临床。

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六、白喉（G+、3无、棒状杆菌属、是放线菌、异染颗粒、亚碲酸钾培养基-黑灰色、免疫沉淀实验/Elek平板测外毒素）

• 棒状杆菌属、菌体一端or二端膨大呈棒状。此属中致病性最强
• 是放线菌，含（短链分枝菌酸）。无荚膜、无鞭毛、无芽孢
• 革兰染色阳性、美兰染色着色不均，呈 着色深的颗粒。
• 奈瑟氏染色→菌体黄褐色、一端or二端蓝色or深蓝色颗粒（异染颗粒）本菌形态特征之一

1. 采取标本
   棉拭子--咽喉、鼻腔、皮肤病灶，发现假膜、则假膜边缘下取样。
2. 分离病原

• 用于筛选：亚碲酸钾培养基
• 常规培养：吕氏血清斜面、哥伦比亚血培养基

亚碲酸钾培养基：生长较慢、需48 h↑，黑色or黑灰色菌落、圆形稍隆起
吕氏血清培养基：24~48 h，乳白色、圆形稍隆起、有光泽。

3. 病原鉴定

• 致病物质→外毒素、非细菌侵袭本身，仅携带β-棒状杆菌噬菌体的溶原性白喉杆菌才能产生外毒素
• 白喉毒素→β-噬菌体毒素基因（tox+）编码的蛋白质
  PCR扩增tox基因→辅助诊断、不能确诊(不能说明该基因是否表达)
• 免疫沉淀实验（Elek平板实验）--检测白喉杆菌是否产生白喉外毒素。是诊断的关键实验

4. 抗体检测
   白喉外毒素→抗原
   ELISA 测抗外毒素特异性IgG抗体，双份血清4倍↑→可诊断为感染
   1978 开始百白破计划免疫

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七、百日咳（鲍特菌属、G-、包-姜培养基、珍珠状菌落、CHO细胞凝集-PT抗原、FHA抗原）

婴幼儿多见、阵发性痉挛性咳嗽、鸡鸣样吸气吼声。病程长达2~3个月→百日咳
百日咳杆菌，鲍特菌属，短杆状or椭圆形
56℃ 30 mins、日照1 h，死亡；干燥尘埃 3 d。

1. 采取标本
2. 咳碟法：包-姜培养基（含青霉素G）的培养皿、潜伏期/卡他期、口前10 cm、飞沫喷射。37℃、2~3 d。
3. 鼻咽拭子法：棉拭子-鼻腔→咽部，青霉素G的包姜培养皿，37℃、2~3 d。拭子放入1%蛋白胨生理盐水试管，2 h内接种
4. 分离病原

• 初次分离：包-姜培养基、2~3 d，银灰色、不透明、珍珠状菌落
• 加血培养基上、绒毛状狭窄的溶血环
• 液体培养基中浑浊生长，管底有少量粘性沉淀

百日咳杆菌常发生光滑型（smooth form）→粗糙型变异，S-R变异，称为相变异。
Ⅰ相菌-S型，ⅡⅢ相-过渡型，Ⅳ相-R型。

急性期初次分离为Ⅰ相
疾病晚期or多次传代后可出现Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ相变异

鉴定：主要依据菌落性状及凝集实验-CHO细胞凝集活性实验

3. 快速诊断

• PT抗原(百日咳毒素) CHO细胞凝集、ELISA检测
• FHA抗原(丝状血凝素) ELISA检测

4. 抗体检测
   试管凝集实验、微量凝集实验
   常用ELISA测IgM、IgA、IgG抗体 IgG 4倍↑确定感染

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八、脑膜炎奈瑟菌（CAP、BAP、咖啡豆型双球菌、Kovac氧化酶试验+糖类反应确认、乳胶凝集试验-沸水浴5 mins）

流行性脑脊髓膜炎，表现为脑膜炎&血液感染（菌血症），可同时出现，更多以单一类型为主要表现。
荚膜多糖不同，分为13个血清群，ABC三个群占90%以上。

1. 采集标本
   脑脊液、血液→接种巧克力琼脂平板（CAP）和血琼脂平板（BAP）。
   脑脊液CSF→预热至35℃的转运-分离（T-I）培养基、保温通气（排气针头）、不冷藏。
   T-I培养基，35℃可保持7 d。
   血液→1分钟内注入肉汤中
2. 镜检
   脑脊液离心取沉积物1~2滴涂片，Hucker改进革兰染色
   G-、咖啡豆型双球菌。
3. 病原分离
   脑脊液沉积物1滴画线接种培养基。
   T-I培养基运输→孵育24 h→BAP和CAP，画线分离。
   血液→血培养瓶，塞有棉花的无菌针头排气，35~37℃培养
   BAP平板：圆形光滑湿润光泽、中央凸起、有完整边界。培养物灰色
4. 病原鉴定

• Kovac氧化酶试验，10秒内紫色，阳性。不延迟。
  用糖类反应确认
• 基于荚膜多糖、13个血清型。A、B、C、W135、Y最常见
• 碳水化合物利用实验 验证。4种单糖糖管：葡萄糖+、麦芽糖+、半乳糖-、蔗糖-。

5. 快速检测方法
   乳胶凝集试验
   玻片凝集法：CSF脑脊液上清试验前沸水浴5 mins，加试剂摇动2~10 mins

• 轻微牛奶状外观 阴性

• 乳胶颗粒凝集 阳性