(3)转录组之数据质控

质控比较简单，简单到有时你都注意不到他，看看Jimmy老司机是怎么翻车的吧《一个RNA-seq的反思》，或许你将对简单会有不一样的理解。

一、输入数据的准备

fastqc 所需要的输入数据是fastq格式的reads数据或者bam/sam比对数据，所以我们需要先将从SRA上用prefetch下载的sra格式文件做下转换。

source activate biosoft # 首先激活安装有sra-tools的conda环境，我这里是biosoft，你们根据自己的环境改
fastq-dump --split-3 --gzip SRR3589956.sra # 带上--split-3选项可以自动识别并处理单端和双端测序reads, 带上 --gzip对结果压缩下免占空间

如果有很多要dump那就做个循环吧(把下面代码放进fastq_dump.sh)

for i in `~/Downloads/SRR_Acc_List.txt `
do
fastq-dump --split-3 --gzip $i.sra
done # 这里又用到了之前从SRA下载下来的那个列表，其中储存着SRR样本

+在终端运行

bash fastq_dump.sh

二、用fastqc做质检

第一部分运行结果中我们得到了每个样本的双端fastq文件分别是形如SRR3589956_1.fastq.gz和SRR3589956_2.fastq.gz

fastqc --noextract SRR3589956_1.fastq.gz SRR3589956_2.fastq.gz # fastqc可以多个输入

或者做成循环应对重复代码

for i in `~/Downloads/SRR_Acc_List.txt `
do
fastqc --noextract $i\_1.fastq.gz $i\_2.fastq.gz
done

关于fastqc结果，这篇博文《fastqc结果解释》应该是已经讲解的比较详细了，推荐大家看看。

以下是我个人的一些理解
对于质检报告给出的每张图我们都要弄清楚以下三个问题：看什么、怎么看、有何结论

质检报告概述

主要是对整个质检报告的总结
(1) 看什么？
第一次看肯定是先了解下这12大条都是什么意思（包括三大方向测序准确性、序列具体内容组成和序列特征）。
在这里主要看条目前面的标记。
(2) 怎么看？
绿色勾勾：合格的
黄色叹号：触到了警戒线
红色叉叉：不合格
并不是说都是绿色你的数据就安全了，有多项红色就放弃数据了，查看后面的具体项目内容是很重要的，这步不认真对待后期分析就可能出现你无法解释的结果。
(3) 有何结论
单从我这个数据来看，有三项不合格，一项警告，对于不合格项和警告项往下看的时候要特别关心。

基础统计信息Basic Statistics

这项主要是测序数据的统计摘要
(1) 看什么？
看下reads长度、GC含量，还可以了解到总共有多少条reads，质量超差的reads有没有
(2) 怎么看？
表格数据应该一目了然了，reads长度=51，GC含量=50%，不同测序仪能达到的最大读长差别较大，可以去相应官网查询比如这里的illumina可以达到2X150bp；这个样品测序得到的reads数是28856780条（这个和覆盖度有关）
(3) 有何结论
reads长度符合仪器标准，GC含量符合理论（研究特殊区域要特殊对待）。

某一位置上所有读段的测序质量评分Per Base Sequence Quality

这项主要反映测序仪对碱基的识别准确性
(1) 看什么？
主要看黄色box（25%和75%分位数）和红色短线（中位数）处于的位置，其实就是个boxplot。
(2) 怎么看？
横坐标各数字表示读段上的位置，最大值即为读长。纵坐标表示质量的好坏（判断的准确性），被分成了绿（合格）、黄（警戒）、红（不合格）三段。
(3) 有何结论？
全在绿色范围，质量超好，说明透过测序仪测得的数据接近真实碱基排列。前13个的box几乎被压成了一条线说明每条reads上该部分，测序仪对其识别的能力几乎一样没有分别，可以推断可能的原因就是序列是固定的几种。

每次荧光扫描的质量Per Tile Sequence Quality

这项是针对illumina数据的
(1) 看什么？
看图上有无亮色出现
(2) 怎么看？
冷颜色表示高于平均值，亮颜色表示低于平均值
(3) 有何结论？
我用的这个数据全图冷颜色所以tile质量好

读段的质量得分分布情况Per Sequence Quality Scores

前两项观察角度是单个点，这项针对的单位是读段
(1) 看什么？
一看横坐标分值范围，二看红色曲线的走势，三看峰的位置。
(2) 怎么看？
横轴上数值应该比较大（>20的分数才是可靠的），红线上的每一点表示分值（X轴）所对应的reads的数量（Y轴），面积就是reads总数了。
(3) 有何结论？
从图中可以看到红线为单峰（窄而高），并且分值在38（>>20），所以每条reads的可靠性很高。

每个位置的4种碱基的比例图Per Base Sequence Content

前面数据准确性确认之后就可以看看具体的数据内容了，这项看的是每个位置上ATCGG的比例。
(1) 看什么？
看四种颜色的线
(2) 怎么看？
每条线在某一位置上对应的Y值代表其比例，
如果序列是随机的那么比例应该在25%左右，四条线应该几乎在同一水平线位置。
(3) 有何结论？
四条线总体平行行走于25%水平线说明总体质量可以，问题出在前10个位置，四条线严重分离，说明有碱基偏向性，很可能就是接头序列。