200升蜜环菌液体菌种罐操作

摇瓶的制作

一:母种的选择，挑选无任何可疑，没染有杂菌母种，选择粗壮洁白品质好的母种，菌丝刚长满试管或满管10天以内的试管母种。

二:培养基的制作配方:

a:土豆20%；麦麸4%；葡萄糖2%；蛋白胨0.3%；磷酸二氢钾0.2%；硫酸镁0.1%；消泡剂0.2毫升，水1000毫升。

b:土豆20%；麦麸5%；葡萄糖1%；红糖1.5%；蛋白胨0.2%；磷酸二氢钾0.2%；硫酸镁0.1%；VB1 10毫克；消泡剂0.2毫升，水1000毫升。

c:土豆20%；麦麸5%；葡萄糖2%；红糖1%；蛋白胨0.3%；酵母膏0.3%；磷酸二氢钾0.2%；硫酸镁0.2%；VB1 10毫克；消泡剂0.2毫升，水1000毫升

土豆选用新鲜无绿皮和芽眼的，麦麸选用新鲜无霉变的的大麸皮。土豆削皮挖去芽眼，切块或薄片后与麦麸同煮，煮沸后文火维持20-30分钟，用6层纱布过滤取汁，汁液不足1000毫升加水补足，加其它原料煮沸至完全溶解，用量筒分装入摇瓶中，1000毫升摇瓶装500-600毫升培养液。

摇瓶用棉塞塞口并覆盖报纸，报纸用线绳或橡皮筋扎紧。摇瓶放入手提高压灭菌锅中，在温度121°c-125°c灭菌40分钟，待压力表指针自然回零后，打开锅盖，稍敞开锅盖以利用余温烘干棉塞，30分钟后取出摇瓶，自然环境下降温。

三:接种待培养基温度降至25°c以下时，将摇瓶、母种、接种工具、气雾消毒剂等放入接种箱，若用超净工作台接种就不用气雾消毒剂了。气雾消毒剂消毒30分钟，超净工作台紫外线开启20-30分钟后即可接种。先用酒精擦拭双手后再进入接种箱，在接种箱内再次用酒精棉擦拭双手、试管母种、接种工具。接种铲、接种钩在酒精灯火焰上方烧灼至彻底灭菌。把摇瓶放到支架上调整好倾斜角度。在酒精灯火焰上方拔去试管棉塞，先用接种钩将菌种横切分成若干0.2---0.5厘米宽的小块，在酒精灯火焰上方打开摇瓶棉塞，用接种铲尽量少带琼脂培养基，铲4-5小块接入摇瓶中，菌种块要菌丝朝上放入摇瓶液面上。接种后棉塞过火两圈后塞好瓶口，包好报纸。

四:培养摇瓶适温静止1--2天后，观察菌丝长势和是否被杂菌感染。确定没有染菌后放到回旋摇床上恒温震荡培养，或将摇瓶置于电磁摇床上，调整转速以产生1厘米深的漩涡为准，恒温培养，每天观察菌丝长势，随着菌丝量的增加转速会降低，让其始终保持1厘米深的漩涡。4-5天后培养完成，以放置20分钟后菌丝沉淀量达85%以上才可接种到发酵罐。

发酵罐的制作  :200升发酵罐可装培养料最适160升，最多180升。发酵罐灭菌时共有3根（3000W/根）加热棒，外加层保温棒一根（2000W/根）同时工作，功率共11KW。

一:上料

1:打开发酵罐上盖，冲洗罐体。

给罐内加入自来水，加到罐体视镜下方，同时外加层注水位置为长条视镜上2/3处为宜。称量专用培养料，950克/百升，160升即是1520克，加入专用消泡剂32毫升，用塑料桶把料稀释开，另加红糖1600克（1000g/100L），葡萄糖800克（500g/100L）,糖类也先用水稀释开和培养料一起加入罐体内。上料前先打开气泵给罐体通气，水流动后加入各种料，在气的搅拌下料不会沉淀结块，很快松散于水中，培养液液面超过视镜不外流为止。盖上盖子并拧紧，打开盖子上的排气阀门，进行灭菌。 三:培养基灭菌1:将加热开关（设定仪表温度125°C）和保温开关（保温灭菌时间设定60分钟）同时打开加热，当仪表温度达到125°C时其自动计时，维持罐内125°C 温度60分钟自动报警结束，关掉加热开关和保温开关，同时在外加层下阀门处接好自来水管，注入自来水前先打开外加层上排水阀门，排水阀门接好排水管通入下水道。排掉外加层内的蒸汽，打开自来水开关和外加层下阀门，外加层加冷水给罐体内培养基降温，水满自流排入下水道。待罐内压力降到0.05MPa时,打开罐体上的进气阀门，给罐内通气搅拌，使罐内总保持正压状态，这样即使罐体上配件有轻微漏气时也不会使外界空气进入罐内造成感染。通气后罐内压力维持在0.03-0.05MPa的气体搅拌状态，待罐内培养基温度降到25°C以下时开始接种。

2:过滤器灭菌罐内培养基刚开始灭菌时，气泵要通过过滤器给罐内通气搅拌着，这样避免了培养基分散不均、沉淀、结块和糊加热棒现象。当培养基温度达到98-100°C，即水的沸点时，停止气泵通气搅拌，因培养基和水都处于沸腾状态，不会再发生培养基沉淀、结块、糊加热棒情况了，此时要微开排气阀门。当罐内温度达到仪表设定温度125°C时，打开罐底放料阀门排一次气，关闭罐体三通上的进气阀门，打开三通上的排气阀门（没连接软管）和总开关，用1000毫升量杯接料，排料一次，关闭排气阀门和总开关。此时仪表自动计时，打开外加层三通阀门的供气阀门，打开过滤器底部阀门微排尾气，打开罐体三通上的进气阀门和排气阀门（微排），通蒸汽给过滤器灭菌。过滤器和罐内培养基灭菌60分钟是同步的。灭菌结束后，关闭三通上的排气阀门，依次关闭第二、第一个过滤器底部阀门，关闭外加层的通蒸汽阀门。打开气泵通气，打开过滤器底部阀门，打开罐体三通上的进气阀门和排气阀门（微排），用气吹干滤芯。待压力表降到0.05MPa时，依次关闭排气阀门、过滤器阀门和底部总进气阀门。打开过滤器上总进气阀门和罐体上三通阀门的总开关给罐体通气，保持罐内正压，待罐内料温降到25°C时接入菌种。 四:发酵罐接种1:准备工作 摇瓶菌种、酒精棉、起保护作用的火圈（浇足95%酒精）、镊子、湿毛巾等接种物品准备好。

3:火圈套在接种口上，大开排气阀门，气泵持续通气，待罐内压力降至接近0时，点燃火圈，关闭排气阀门，旋开接种盖，在火焰上方拔去摇瓶菌种棉塞，在火焰保护、接种口是正压状态下把菌种倒入罐里，接种盖在火焰上方过火盖好接种口并拧紧，撤去火圈，用湿毛巾铺灭火。打开排气阀门微排，调整罐内压力至0.03-0.05MPa,设置好培养温度即可进入培养阶段。3:培养品种不同设定培养温度不同（一般18-28°C），罐压维持在0.03-0.05MPa，一般品种培养周期为72-96小时。

4:菌种检测检测方式有感官检测、显微镜检测、培养皿检测，木屑培养料检测，PH值检测，糖分检测等……最简便方法是:观察菌液颜色清澈透明，菌丝（菌球）还是以检测为安全，菌丝明显活力强，菌液从开始的香甜味变成后期淡淡的菌香味，没有酸臭味。