实验复盘（二）------无缝克隆那(fan)些(che)事(le)?

Pre：好久没更新了，存稿发起来！

  这一次实验复盘，主要是想总结一下自己最近做的无缝克隆实验。之前一直纠结在自己的PCR世界。。。。。(还是需要多思考！)，最近折腾无缝克隆，目的呢是用来构建多顺反子（通俗一点就是融合蛋白的表达）。

PS：这篇小结主要讲的是Gibson流派的无缝克隆
(因为golden gate 系列还没用过。。。。。)

一：无缝克隆简介

  无缝克隆是可以把多个片段通过重组的方式连接到一起，省去了中间搭桥PCR的繁琐的过程。而且可以连接多个片段成为最大优势。除了各大品牌的无缝克隆的说明书以外，我认为无缝克隆介绍的最好的应该是这篇帖子：
无缝克隆，让载体构建变得像搭积木一样简单
  用一张图来说明一下无缝克隆的概念情况：

无缝克隆的原理.png

（图片来源： C115-ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit）

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虽然看上去挺简单的，但是做起来有一些坑还是得注意的！

二：无缝克隆的Q&A

Q1：如何构建线性化的载体?

  对于线性化构建载体有几种方式：

1）可以通过酶切的方式去线性化质粒，需要在质粒上找到合适的酶切位点（位点单一的且现有的限制性内切酶效率高的）

Tips:如果是双酶切的话比单酶切的效果可能要好一些，原因一是单酶切容易切不干净，而且没办法通过跑胶的条带去判断！原因二是单酶切线性化质粒之后如果是黏性末端的话有可能会有一些载体重新连接的情况发生

2）可以去通过PCR质粒的方法去线性化质粒，设计同源臂引物，去把整个质粒扩增下来

Tips:个人首选推荐还是用PCR的方法环P质粒，既保证得到线性化的质粒（经过了DpnI消化后），然后也让质粒载体上带有了同源臂，可以提高重组的效率！
  但是！如果是质粒偏大（8K以上）的话不是很推荐这种方法，容易引起新的突变。

Q2：如何构得到带有同源臂的片段?

  其实这个还是比较好设计的。首先，NEB有专门设计这种带同源臂的引物的网站：http://nebuilder.neb.com/
  如果是用了国内的一步克隆的试剂盒，比如国产的诺唯赞的C115系列试剂盒等，他们也有提供专门的小程序去帮忙设计带有同源臂的引物

Tips:用网站或者是小程序的话，只要是把载体序列，插入的目的片段，酶切位点什么的标注清楚就可以了。
1：选择酶切位点的话，一定要选一些限制性内切酶比较好用的酶切位点。
2：酶切位点附近的序列GC含量不要太高或者太低，要不然会导致重组效率非常的低
3：如果要做酶切的话（这里指双酶切），看清楚酶切的buffer，不同的酶可能buffer不同
4：个人经验一般有20bp左右的重叠区就满足大部分同源臂的要求，除非遇到序列GC含量比较异常需要增加或删掉一些碱基数。

  最后一点想说的是！虽然网站设计出来的引物序列基本没啥问题，但是具体的引物设计的结果，还是得自己在snapgene（或类似的基因编辑软件）里面看一下， 引物到底合不合适！不要懒这一下！！！（曾经在这上面翻过车的表示真的需要好好检查！）

Q3：每个组分加多少？

  这个就直接安装说明书上的推荐来。因为他们都是经过了实验的优化的，不会导致做不出来。
  不同的厂家的试剂盒里面加的每个部分的推荐量不同，得根据说明书上推荐来，不能乱套用别的体系，因为不同厂家的试剂配方，酶什么的都是不一样的。（PS：有的试剂盒是大片段多加点，有的试剂盒是大片段稍加点，所以好好研究说明书非常有必要！！！！！）
  加的量一般是和载体或者是片段的长度有关的，加入的量是可以根据pmol换算公式得到的！
  Notice:在这一步之前，胶回收的产物一定要确定无乙醇等残留，A260,A280比值正常，峰图正常再去做后续连接。如果胶回收产物有问题，那么连接效率更低！

Q4：后续的涂板转化？

  这都属于常规操作，有一点在转化 感受态的时候，如果无缝克隆体系偏大，那么感受态的体系也偏大一些，因为转化是和菌的渗透压有关系的。转化完后，摇菌一小时，涂板，过夜第二天挑菌做菌落PCR，有阳性克隆了再摇菌，提质粒送测序。

上一张菌落PCR的结果：

菌落PCR结果，有特异性条带的是重组成功

1kb marker

Ref:
1: http://www.vazyme.com/companyfile/136.html
2:http://nebuilder.neb.com/
3:https://international.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix