分子生物学问答题

问题如下：

1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项以及它在临床与科研中的应用。
2. 基因克隆技术的原理和方法是什么？在医学上有何意义?
3. 试述Sanger DNA测序技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
4. 试述Western Blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用
5. 结合自己的专业，试试述分子生物学技术在医学临床与科研中的应用。
6. 试述你认为最重要的医学课题，并阐述理由。

后面是我搜集整理的资料，并以此做出的答案。

荧光定量PCR

1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项以及它在临床与科研中的应用。

• 原理：
  • 1．荧光共振能量传递 (FRET)
    某荧光标记基团在-激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。
  • 2．荧光化学：
    荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
    探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
    
    

    荧光探针在PCR中的变化
  • 3. 定量分析
       利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。
       
       

       定量分析

阈值（threshold）： 在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。
Ct值（Cycle threshold）： 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。

• 方法

  • 实验设计

    • 1. 靶基因选择 选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性(漏检)。
    • 2. 检测片段的确定 选择检测组内的保守 (突变少)（避免假阴性）、组间特异的序列 (突变多)（避免假阳性）作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。
    • 3. 引物 长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃；避免稳定的引物二聚体（特别是多联检测）及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出现连续的G，3’端避免G或C，最后5个碱基内避免两个以上的G或C。
    • 4. 探针 长度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值为68-70℃；避免稳定的二聚体及发夹结构 (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置尽量靠近上游引物；选择波长差异较大（多联检测）或Fam(单联检测）的荧光标记。

  • 样品的处理

    • 选取合适的无污染混杂的组织
    • 提取核酸
    • 逆转录得到的RNA为cDNA
    • 精度要求较高的定量PCR寻找内参
    • 分装加样
    • 掺入ROX参比荧光
    • 重复操作

• 注意事项

  • 优良试剂的选择。
    Real Time PCR试剂的选择是否合适，也是实验成功的关键点，所以在这里有必要对试剂的选择要点加以说明。
  • 引物和探针的设计
    探针和引物设计原则前面有述及
  • 反应条件的优化
    依据所使用的产品说明书进行反应条件的优化
  • 实验操作防止污染
    必须分区操作。通常分为：反应液调制区；模板添加/样品制备区；PCR反应区。

• 应用
  Real Time PCR是具有划时代意义的技术，具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，临床方面，感染性疾病的诊断，包括“窗口期”早期诊断和病情轻重判断。研究方面，应用于基因表达解析、SNP分型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测。
  详细描述见这里和这里。

基因克隆

2.基因克隆技术的原理和方法是什么？在医学上有何意义?

分、切、连、转、选

• 原理
  用分离纯化或者人工合成的目的基因，在体外与载体DNA（质粒或者病毒等），形成重组体并转入宿主细胞（细菌或者其它细胞），通过在这些宿主细胞内扩增、繁殖，以获得大量拷贝的目的基因，或者使这些目的基因继续在宿主细胞中表达其编码的多肽。
• 方法
  • 1. 分 分离制备合格的待操作的DNA，包括载体DNA和目的基因的DNA。
  • 2. 切 用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA和目的基因。
  • 3. 连 用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子。
  • 4. 转 用特殊的方法将重组的DNA分子送入到宿主细胞中进行复制和扩增。
  • 5. 选 从宿主群体中挑选出携带重组DNA分子的个体。
• 意义
  基因克隆在整个生命科学中都意义重大，在医学领域稍举例如下：

培育优良的实验模型
生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法
生产转基因的产品，如人类胰岛素

Sanger测序

3. 试述Sanger DNA测序技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。

1953年，FrederickSanger 发明了双脱氧核苷酸末端终止测序法。该方法被用于人类基因组计划的测序。这是第一代测序技术。

• 原理

  • 首先，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子。

    
    
    

  • 其次，利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP 3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。

• 方法

  • 测序时分成四个反应, 每个反应除上述PCR体系的成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。

在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。其他的三个反应也是类似的。这样根据链延伸长度和在哪一个反应中截止，就可以知道最后一个加上去的核苷酸是AGCT中的哪一个了。

制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

• 注意事项
  分离纯化模板DNA时，注意：不要使用DEPC处理的水，水中不能有EDTA，否则将抑制测序反应。DNA模板定量分析，准确定量DNA模板。和普通PCR相比，注意测序PCR，使用的引物为单向，且对模板的浓度及纯度要求相当高。

• 应用
  Sanger测序是一代所有测序和新一代所有测序的金标准。

  • 在医学领域，用于精准检测，寻找突变，发现突变与疾病(或能力、特点)的关系。包括单基因遗传病检测、易感基因精确筛查、健康能力基因检测、个性化用药精确检测、血液和器官配型基因检测、天赋基因检测、个性特质、性格特点基因检测等。目前该技术已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。
  • Sanger 测序可以助力癌症病人个性化用药。
  • 为二代和芯片测序验证。
  • 应用于细菌、真菌鉴定。
  • 亲子鉴定、法医鉴定。

Western Blot

4. 试述Western Blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用

• 原理
  Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
• 方法
  样品制备-定量-跑胶-转膜-封闭-孵育-检测

注意事项：
①在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；
②不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白
③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键、二硫键；对于多亚基蛋白或含多条肽链的蛋白，SDS—PAGE只能测定它们的亚基或单条肽链的相对分子质量。
④尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子；
⑤蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶对其进行修饰
⑥尽量使用新鲜的loading buffer，样品要与loading buffer混合均匀，
⑦不可将蛋白质反复冻融使用以防改变蛋白质的抗原特性，
⑧Buffer一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋白跑不动；
⑨电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，特别是对于高分子量的目的蛋白，
⑩硝酸纤维素（NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小； 非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。

• 应用
  疾病诊断
  基因表达水平半定量
  蛋白分离和定性
  蛋白质组研究

自由阐述分子生物学技术

5.结合自己的专业，试试述分子生物学技术在医学临床与科研中的应用

口腔医学
基础
牙胚发育研究
唇腭裂的SNP
癌症的研究
临床
癌症的诊断
疾病分型

重要医学课题

6. 试述你认为最重要的医学课题，并阐述理由。