#R##Phylogenetic tree#construction methods tips caution

1.获取序列

一般从GenBank搜索比对下载，形式类似

>gi|584292432|gb|KF850545.1| Pseudomonas stutzeri strain DQ1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence​

AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCC​...

大于号后分别是gi号、gb号（或其它）、物种菌株、序列类型等等。换行是实际序列。

如果我们已知gi号或gb号，可以在R中直接从GenBank下载，而且有一个好处是下载的内容包含物种名，可以直接用于树的tip。

library(phyloch)​##载入包，自动载入ape

#Loading required package: ape

#Warning message:

#package ape?was built under R version 3.2.3

sylvia.seq <- read.GenBank(x)##x就是包含gi号的向量

attr(sylvia.seq, "species")##查看下载序列文件的物种名

当然如果有的序列中有相同的物种，只保存序列就可以了，但是要把每个序列的名字替换一下，用1:length(x)替换，后边构树还要替换成实际的tips。这时应该做的是把GenBank下载的文件读到R中，把每个序列的大于号提取出来，就是每个序列的 name，保存成excel能打开的格式（txt），因为有“|”的存在所以很容易分成若干的列，最后一列就是物种名，但是要去掉序列的类型信息。

2.比对

序列比对有很多软件可以使用：clustal（sylvia.clus <- clustal(sylvia.seq, exec = shortPathName("C:/Program Files/ClustalW2/clustalw2.exe"))）、mafft（sylvia.maff <- mafft(sylvia.seq, path = "D:/R/tree/mafft/mafft.bat")）等。对于16S，可以用在线数据库比对，比如silva。silva的设置比较简单，建议选择最下边那个，把末端没有比对上去的去掉。

silva.png

当然，clustal等的比对也可以用在线的方式，有很多做这个事情的网站。

silva的比对参考序列非常大，所以比对后的文件相应地也很大，插入很多没有比对上去的“-”。如果候选的序列在某个位置全部是“-”，这是无效的信息，构树前还是要去掉。用mothur（mothur > filter.seqs(fasta=amazon.unique.align, vertical=T) ##fasta文件名中不能有短横线）。这样得到的序列文件中，序列末端若是没有比对上则是一个点，要替换成问号（ml）或是N（bayes）才能构树。ml的格式fasta就行，bayes要nexus（ev.seq<-read.dna(Myfile,format = "fasta");write.nex(ev.seq,file = "ev.nex")）。

3.构树

构树一般有3种方法，ml、bayes和mp，这里只用前两种。构树是件消耗电脑资源的事，本地没有服务器的话就不要用小本本跑了，推荐在线服务器The CIPRES Science Gateway。

• ml的设置

  
  
  

  cipres.jpg
• bayes的设置
  
  

  bayes.jpg
  
  所得的文件RAxML_bipartitions.result和infile.nex.con.tre，要在R里替换实际的tips。
  tr$tip.label，去掉[]和""，并在数字间加上逗点，

taxa.ev<-genbank.no[,5]##保存的excel表，[,5]表示实际的物种名在第五列
taxa.ev<-as.character(taxa.ev)
tr$tip.label<-taxa.ev[c(1,70,2,3,4,...)]

然后就可以作图了。

4.显示

pdf("tr.bayes.0504.pdf", family = "serif",width = 15, height = 25)
plot(ladderize(tr,F), no.margin = TRUE, font = 1)##阶梯型排序
nodelabels(tr$node.label,adj = c(1, -0.5), frame = "none", bg = "white")
add.scale.bar(1,1,length = 0.1,lcol = "red")
dev.off()

bayes输出的文件是nex格式，只保留树的信息，其他删除，才能读到R里。替换tips后保存树，用Figtree加上bootstrap和后验概率值，还有能够合并类似tips，tips是斜体等优点，设置好后输出成PDF。最后用illustrator编辑修改，比如枝加粗、加箭头。

tree1.png

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上面是核酸序列，有时需要用氨基酸序列构建系统发育树，步骤相似，关键区别在于替换模型的选择。核酸序列一般用的模型有GTR相关，蛋白则常用WAG和LG相关，这些多数可以在这个聚合网站上实现。

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ps一些文章中相关方法的摘抄

bayes.png

ml1.png

ml2.png