分析记录|三代细菌基因组理论相关

1.组装

1. 小基因组比如细菌的（不到10M）可以直接用HGAP3。直接在网页版跑，（<100M)都可以。
2. 端口配置。SMRT-analysis所有浏览器通用。SMRT-link只在chrome上使用。另外，pacbio的分析软件最好在已配置SGE的服务器上跑。
3. 重要参数：基因组大小，最好询问客户；习惯值5M
4. 耗时：0.5-1d

2.任务指标

1. 真菌基因组组装结果是多个contig。指标是contig N50 （>1M)?
2. 细菌基因组组装结果是一个contig，指标是完成图。

3.N50介绍

1. contig N50
2. scaffold N50

以contig N50 为例。
Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs.将所有的Contig长度相加,能获得一个Contig总长度.然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序,如获得Contig 1,Contig 2,contig 3...………Contig 25.将Contig按照这个顺序依次相加,当相加的长度达到Contig总长度的一半时,最后一个加上的Contig长度即为Contig N50.举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度*1/2时,Contig 4的长度即为Contig N50.ContigN50可以作为基因组拼接的结果好坏的一个判断标准.
成功注释基因组的第一步就是看组装有没有达到要求，除了一些统计指标来表述组装的完整性和连续性之外，最重要的就是N50.尽管没有绝对的标准，但是对于基因预测而言，n50达到基因的平均长度是一个合理的目标，原因十分简单：基因中约有50%有望包括在单个scaffold或者contig中。

2. 流程

2.1 组装

1. 进入SMRT Portal。

2. 如何知道编号：下载原始数据中的meta.xml文件，浏览器打开。查看sample name。

   
   
   
3. 导入原始数据：增加路径，只用填入cell文件夹所在目录。scan和导入。
4. create new job：通过sample查找。也可以通过url查找。
5. HGAP3 protocol，点省略号，在assembly中填写基因组大小。按以下步骤：

• 5M或别人提供大小：看contig和N50，及contig length。
• 根据contig length（后续怎么调参数都不会怎么变了，这个基本就是基因组的大小）比如11M
• 11M尝试：看contig和N50
• 11.5M尝试：看contig和N50
  复杂的基因组，比如11M算比较大的了，可以尝试用smrtlink也做一下。

6. 图片结果：
   /opt/pacbio_soft/smrtanalysis/current/common/userdata/jobs/016/016888/results
   下载coverge和post_filter的png。

2.2 甲基化

1. 导入已经组装的基因组
   方法一：import and manage -> select reference 上传
   有时会失败
   方法二：/opt/pacbio_soft/smrtanalysis/common/references_dropbox 服务器上传,目前无权限..
2. protocol： RS-modification-and-motif-analysis,选择上传的参考基因组
3. 甲基化结果：
   /opt/pacbio_soft/smrtanalysis/userdata/jobs/016/016497/data

2.3平台

smrtlink可分析sequel和RSII。RSII的数据导入后，选择显示RSII数据，有protocol转BAM文件（就是sequel下机的数据）。然后继续分析。
smrtportal只能分析RSII。
不同平台的同一个样本的数据最好都导入smrtlink一起来分析。

其他

1. contig和scaffold：
   scaffold—二代测序才会有，一般是contig因为pair end再次连接得到scaffold
   三代只会得到contig

2. RSII和sequel的数据会有很大的差别，数据产量，格式，读长都会有一定的差别。
   sequel p1：35.7% RSII：74%
   但数据都是有效的，合并起来分析就可以
   不同的平台，不能比较P1值

3. 细菌基因组是将完整的基因组打碎来测序，一般构建的是10kb或者20kb的文库
   全长转录组本来就是长长短短的cDNA，因此要根据分析实际来选择，比如选择 大于2kb和小于2kb的文库。来分别针对小的cDNA和长的cDNA。

参考

1. 微信：N50多少，证明组装的好？ link