详说单细胞测序

DNA测序技术的快速发展使得学术界对包括人类在内的各类物种的基因组有了更全面的认识，下一代测序的全基因组扩增（whole-genomeamplification，WGA）在生物学和医学领域都有广泛的应用。

人类对于基因组的普遍认识来源于对一类细胞的全部基因组进行测序，但问题是同一个体中的单个细胞由于后天的环境变化会拥有一个独特的基因组，而生殖细胞也会因携带着来自父亲和母亲基因不同的组合而不一样。

例如，生活中常见的异卵双胞胎和同卵双胞胎之间都有着各自的区别。随着时间的推移，基因组位置会发生随机变化，体细胞相应地就会出现基因组变化，这种基因组变异包括单核苷酸变异（single-nucleotidevariations，SNVs）、拷贝数变异（copy-numbervariations，CNVs）和结构变化，常导致癌症和其他疾病。

随着测序技术、单细胞分离技术和全基因组扩增技术的快速发展，单细胞研究技术被列为未来几年最值得关注的技术之一。本文从单细胞研究基本技术和应用两方面对单细胞基因组扩增技术的最近研究进展进行了阐述。

单细胞分离技术

根据所用技术原理，单细胞分离技术可以划分为不同种类（表1）。

对各种主要方法我们介绍如下：

梯度稀释法

梯度稀释法是通过将细胞进行梯度稀释，最终得到单细胞的一种简易方法。

优点：技术简单、成本低，对于可以进行培养的样本研究均可用该方法得到单细胞；

缺点：在细胞稀释过程中容易出现分离错误或者丢失。

微流控技术

微流控技术是使用具有专用微流体芯片进行平行单细胞分离，捕获单细胞。微流体装置具有集成的细胞分选器，用于分离选定的单个细胞，从而允许灵活的样品选择且封闭的操作空间可以有效地避免污染。

荧光激活细胞分选

荧光激活细胞分选（FACS）技术借助流式细胞仪，单个细胞有序地通过激光束，利用激光激发荧光素标记的细胞，根据激发的荧光信号对细胞进行高度特异性分选，含有靶细胞的液滴被选择性地偏转到收集器中，是比较常用的单细胞分离技术。

FACS系统是在单细胞基础上分离靶细胞，具有更高的分选准确度。虽然非常有效和准确，但复杂的分拣机制使得FACS系统显得昂贵且笨重，并且潜在的气溶胶也有一定的危险性。此外仪器中快速流动的液体可能会对细胞的活性和形态状态产生一定的影响，但是对于基因组DNA的研究没有影响。

显微操作技术

显微操作技术是利用显微镜直接进行单细胞的分离，是一种较常用的灵活获取单细胞的技术。

显微操作系统以倒置显微镜为主，其关键技术要点在于对培养的细胞进行梯度稀释，如果细胞浓度过高会影响分离和挑取单细胞的准确性。

优点：操作容易进行、可以直接通过可见视野直观地分离单细胞、成本低、主要是用于较小细胞群体的目标细胞的分离。

缺点：通量低、分离过程可能会损伤细胞、而且细胞识别出错率高。

激光捕获显微切割

激光显微切割可以在不破坏组织结构，并保证周围组织完整性的前提下将特定的单个细胞从不同的组织中分离出来，此方法常应用于与人类健康相关的单细胞基因组学研究。

缺点：成本较高、切割不精确，可能会造成遗传物质的丢失。

单细胞基因组扩增技术

引物延伸预扩增法

引物延伸预扩增法（PEP）是一种出现较早的WGA技术，这是一种基于PCR技术的WGA方法。主要是使用了含15个碱基的随机引物，在37℃下退火，并在55℃进行延伸，如此循环复制。

简并寡核苷酸引物PCR技术

基于热循环以PCR为基础的简并寡核苷酸引物PCR技术（DOP-PCR），其采用部分简并序列的寡核苷酸引物（引物中间部分含有6个随机碱基），用于基因组作图研究。该技术在最初几个循环，利用低初始退火温度（~25℃）的PCR方案确保引物与模板结合，从给定基因组内的多个均匀分散的位点引发。此后进行较高退火温度（~55℃）的常规多循环PCR反应。

多重置换扩增

多重置换扩增（MDA）是等温的链置换扩增。在恒温条件下，由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火，紧接着在phi29DNA聚合酶作用下发生链置换反应，置换后的单链又可与引物发生随机结合、退火、延伸，最终形成分支扩增。

多重退火和基于环状循环扩增技术

多重退火和基于环状循环扩增技术（MALBAC）是美国国家科学院院士谢晓亮教授所带领的团队在2012年发表了一种新的WGA方法，其引入了拟线性预放大，以减少与非线性放大相关的偏差。MALBAC结合了MDA和基于PCR的WGA技术，以人的单细胞的DNA片段（10~100kb）作为模板。

MALBAC由一组随机引物启动扩增，每个引物具有27nt通用引物序列和8nt随机碱基，随机引物可以在0℃下与模板均匀杂交。在65℃和具有链置换活性的DNA聚合酶作用下产生具有可变长度（0。5~1。5kb）的半扩增子，再经过94℃模板变性、0℃退火和65℃延伸一个循环后半扩增子形成末端互补的全扩增子，紧接着将温度降低至58℃，使完整扩增子环化，以防止DNA进一步扩增和交叉杂交。把在5个预扩增循环后得到的全扩增子作为模板，27nt通用引物作为PCR引物，通过PCR指数扩增得到下一代测序所需的DNA。在相同条件下，MALBAC比MDA方法展现出更高、更均匀的基因组覆盖率，但同时也存在假阳性偏高的结果，可能是因为Bst和Taq聚合酶的保真性不高，以至于扩增过程中准确率低，所以MALBAC需要多个细胞基因组才能获得更为准确的结果。

乳液全基因组扩增

乳液全基因组扩增（emulsionwhole-genomeamplification，eWGA）适用于任何WGA，其利用油中的少量水性液滴，均匀扩增单个细胞的基因组。通过将单细胞基因组DNA片段分配到大量（105）皮升液滴中，允许每个液滴中的一些DNA片段达到扩增饱和状态。经过破乳合并液滴后，DNA片段之间的扩增增益的差异显著最小化。与MDA、MALBAC和DOP-PCR比较后的结果表明，eWGA不仅提高了覆盖率，而且能够以更高的准确度和更高的分辨率同时检测SNV和CNV，在许多方面优于现有的单细胞扩增方法。例如，MDA容易受到环境污染，包括试剂中痕量DNA的污染。相反，eWGA通过应用小的反应量，且其反应缓冲液会被分配到大量分离的液滴中，而DNA污染物只存在于一小部分液滴中，不会被过度放大，因此可以有效减少DNA污染物。

利用微流体反应器进行单链测序

SISSOR（single-strandedsequencingusingmicrofluidicreactors）是利用微流体反应器进行单链测序的一种方法。该方法用于精确的单细胞基因组测序和单元型分析。

微流体装置由四个模块组成：单细胞捕获模块、细胞裂解与链分离模块、分区模块和扩增模块。

首先从细胞悬浮液中捕获单个细胞；随后捕获的细胞被裂解，双链染色体DNA分子被碱性溶液分离；之后分离的DNA片段使用旋转泵随机分布，并分割成24个相同的区室；最后每个分区被中和并下推到扩增模块中，由MDA进行扩增。每个腔内的放大产物被检索，最终收集每个区室的扩增基因组DNA合并转换成条形码测序文库（barcodedsequencinglibraries），并使用Illumina的合成短读测序进行测序。利用冗余序列信息和基于单倍体型减少序列错误，平均500kb长的DNA片段可以组装成单倍体重叠群，测序结果错误率低至10-8，而且在更均匀的扩增和更准确的序列比对后可以进一步提高性能。从单个细胞获得准确的基因组序列和单倍体信息将使得基因组测序的应用能够满足不同的临床需求。10xGenomics作为单细胞领域的后起之秀，巧妙使用了Barcoding（条形码）和Microfluidics（微流体）技术，在单细胞分离、扩增原理上具有明显的优势。与二代测序数据相结合，在Scaffold的组装上能够达到媲美三代测序的组装效果。

文章截取自徐晓丽吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)