虽然高通量测序分析最常用的操作是将fastq比对到参考基因组得到BAM文件,但偶尔我们也需要提取BAM文件中特定区域中fastq。最开始我认为这是一个非常简单的操作,因为samtools其实已经提供了相应的工具samtools fastq
.
以biostar handbook的Ebola病毒数据为例,首先获取比对得到的BAM文件。
# 建立文件夹
mkdir -p refs
# 根据Accession下载
ACC=AF086833
REF=refs/$ACC.fa
efetch -db=nuccore -format=fasta -id=$ACC | seqret -filter -sid $ACC > $REF
bwa index $REF
SRR=SRR1553500
fastq-dump -X 100000 --split-files $SRR
BAM=$SRR.bam
R1=${SRR}_1.fastq
R2=${SRR}_2.fastq
TAG="@RG\tID:$SRR\tSM:$SRR\tLB:$SRR"
bwa mem -R $TAG $REF $R1 $R2 | samtools sort > $BAM
samtools index $BAM
让我们尝试提取下前1kb比对的fastq文件
samtools view -h SRR1553500.bam KJ660346.1:1-1000 | samtools fastq -1 read_1.fq -2 read_2.fq -
#[M::bam2fq_mainloop] discarded 0 singletons
#[M::bam2fq_mainloop] processed 8702 reads
看起来似乎我们成功了,那让我们把这些序列比对回去吧
bwa mem refs/AF086833.fa read_1.fq read_2.fq
[mem_sam_pe] paired reads have different names: "SRR1553500.11772", "SRR1553500.43775"
你会发现这里产生了错误。这个错误说的是配对的read名字不同。导致问题的原因是:samtools fastq会按照fastq在bam里原本的顺序进行提取,而按照位置排序的bam的两个配对read并不是前后紧挨着的。所以我们需要进行一波排序。
cat read_1.fq \
| paste - - - - \
| sort -k1,1 -S 3G \
| tr '\t' '\n' \
| gzip > read_1.fq.gz
cat read_2.fq \
| paste - - - - \
| sort -k1,1 -S 3G \
| tr '\t' '\n' \
| gzip > read_2.fq.gz
这里将5个shell命令用管道连起来完成这个任务,咋看起来比较复杂,但是理解每一步的目的,每个参数的作用,以后就能活用起来了。
首先用cat逐行读取read,传入到paste中。paste的作用是将多个文件合并成一个文件,做法比较简单粗暴,举个例子
cat A.txt
A
B
C
cat B.txt
D
E
F
paste A.txt B.txt
A D
B E
C F
cat read_1.fq | paste - - - -
表示读取4行合并成一行。相当于fastq里的read都会用一行而不是四行表示。接着用sort
按照第一行(-k1,1)排序,内存的缓冲数据为3G(-S 3G). 然后将制表符替换成换行符,让一行又变回到4行,后续是压缩成gz,降低磁盘占用。
这样做其实还没又解决问题,因为这两个文件里的reads数其实不相同,我们需要进一步从里面剔除掉只有一方才有的read。这里使用的seqkit
,一个非常强大的序列处理轮子。
seqkit grep -f <(seqkit seq -n -i read_1.fq.gz ) read_2.fq.gz > read_flt_2.fq
seqkit grep -f <(seqkit seq -n -i read_2.fq.gz ) read_1.fq.gz > read_flt_1.fq
wc -l read_flt_1.fq
15028 read_flt_1.fq
wc -l read_flt_2.fq
15028 read_flt_2.fq
终于,你得到了配对存放的两个fastq文件。
通过这个案例我想表达的观点是:虽然有些时候没有现成的工具可以解决你的问题,但是你可以通过组合几个现有的工具来完成。也就是将一个大问题拆解成几个独立的小问题,然后逐个击破。
当然,你首先得熟悉一些已有的工具,比如说常用unix命令:sort, paste, tr等,和一些非常强大生信命令行工具:samtools, bedtools, seqkit等。
一个更佳方便的方法
前面只是问题的一种方法,可能还不是最好的,但是我当初最先想到的一个比较粗暴的方法。当然更佳巧妙的方法是,提取序列之后可以按照read name排序,然后提取
samtools view -h SRR1553500.bam KJ660346.1:1-1000 | samtools sort -n | samtools fastq -1 read_1.fq -2 read_2.fq -s singleton.fq -
是不是更好理解了。
Basic local alignment search tool (BLAST)
包括:blastn, blastp, blastx, tblastn, tblastx等. 使用conda安装即可。
conda install -c bioconda blast
# blast安装perl模块的方法
conda install perl-digest-md5
BLAST的主要理念
- Search may take place in nucleotide and/or protein space or translated spaces where nucleotides are translated into proteins.
- Searches may implement search “strategies”: optimizations to a certain task. Different search strategies will return different alignments.
- Searches use alignments that rely on scoring matrices
- Searches may be customized with many additional parameters. BLAST has many subtle functions that most users never need.
本地BLAST的基本步骤
- 用makeblastdb为BLAST提供数据库
- 选择blast工具,blastn,blastp
- 运行工具,有必要的还可以对输出结果进行修饰
第一步:建立检索所需数据库
BLAST数据库分为两类,核酸数据库和氨基酸数据库,可以用makeblastbd
创建。可以用help参数简单看下说明。
$ makeblastdb -help
USAGE
makeblastdb [-h] [-help] [-in input_file] [-input_type type]
-dbtype molecule_type [-title database_title] [-parse_seqids]
[-hash_index] [-mask_data mask_data_files] [-mask_id mask_algo_ids]
[-mask_desc mask_algo_descriptions] [-gi_mask]
[-gi_mask_name gi_based_mask_names] [-out database_name]
[-max_file_sz number_of_bytes] [-logfile File_Name] [-taxid TaxID]
[-taxid_map TaxIDMapFile] [-version]
-dbtype
具体以拟南芥基因组作为案例,介绍使用方法:
注: 拟南芥的基因组可以在TAIR上下在,也可在ensemblgenomes下载。后者还可以下载其他植物的基因组
# 下载基因组
wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-36/fasta/arabidopsis_thaliana/dna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz
gzip -d Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz
# 构建核酸BLAST数据库
makeblastdb -in Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa -dbtype nucl -out TAIR10 -parse_seqids
# 下载拟南芥protein数据
wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-36/fasta/arabidopsis_thaliana/pep/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz
# 构建蛋白BLAST数据库
gzip -dArabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz
makeblastdb -in Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa -dbtype prot -out TAIR10 -parse_seqids
如果你从NCBI或者其他渠道下载了格式化过的数据库,那么可以用blastdbcmd
去检索blast数据库,参数很多,常用就如下几个
- db string : string表示数据库所在路径
- dbtype string,: string在(guess, nucl, prot)中选择一个
- 检索相关参数
- -entry all 或 555, AC147927 或 gnl|dbname|tag'
- -entry_batch 提供一个包含多个检索关键字的文件
- -info 数据库基本信息
- 输出格式 -outfmt %f %s %a %g ...默认是%f
- out 输出文件
- show_blastdb_search_path: blast检索数据库路径
使用案例
# 查看信息
blastdbcmd -db TAIR10 -dbtype nucl -info
# 所有数据
blastdbcmd -db TAIR10 -dbtype nucl -entry all | head
# 具体关键字,如GI号
blastdbcmd -db TAIR10 -dbtype nucl -entry 3 | head
还有其他有意思的参数,可以看帮助文件了解
可选:BLAST安装和更新nr和nt库
安装nt/nr库需要先进行环境变量配置,在家目录下新建一个.ncbirc
配置文件,然后添加如下内容
; 开始配置BLAST
[BLAST]
; 声明BLAST数据库安装位置
BLASTDB=/home/xzg/Database/blast
; Specifies the data sources to use for automatic resolution
; for sequence identifiers
DATA_LOADERS=blastdb
; 蛋白序列数据库存本地位置
BLASTDB_PROT_DATA_LOADER=/home/xzg/Database/blast/nr
; 核酸数据库本地存放位置
BLASTDB_NUCL_DATA_LOADER=/home/xzg/Database/blast/nt
[WINDOW_MASKER]
WINDOW_MASKER_PATH=/home/xzg/Database/blast/windowmasker
配置好之后,使用BLAST+自带的update_blastdb.pl脚本下载nr和nt等库文件(不建议下载序列文件,一是因为后者文件更大,二是因为可以从库文件中提取序列blastdbcmd -db nr -dbtype prot -entry all -outfmt "%f" -out nr.fa ,最主要是建库需要花费很长时间),直接运行下列命令即可自动下载。
nohup time update_blastdb.pl nt nr > log &
如果你不像通过update_blastdb.pl
下载nr和nt等库文件,也可以是从ncbi上直接下载一系列nt/nr.xx.tar.gz文件,然后解压缩即可,后续还可以用update_blastdb.pl
进行数据更新。
报错: 使用update_blastdb.pl
更新和下载数据库时候出现模块未安装的问题。解决方法,首先用conda安装对应的模块,然后修改update_blastdb.pl
的第一行,即shebang部分,以conda的perl替换,或者按照如下方法执行。
perl `which update_blastdb.pl`
下载过程中请确保网络状态良好,否则会出现Downloading nt.00.tar.gz...Unable to close datastream
报错。
第二步:选择blast工具
根据不同的需求,比如说你用的序列是氨基酸还是核苷酸,你要查找的数据是核甘酸还是氨基酸,选择合适的blast工具。不同需求的对应关系可以见下图(来自biostars handbook)
不同工具的应用范围虽然不同,但是基本参数都是一致的,学会blastn
,基本上其他诸如blastp
,blastx
也都会了。
blastn的使用参数很多 blastn [-h]
,但是比较常用是如下几个
- -db : 数据库在本地的位置,或者是NCBI上数据库的类型,如 -db nr
- -query: 检索文件
- -query_loc : 指定检索的位置
- -strand: 搜索正义链还是反义链,还是都要
- out : 输出文件
- -remote: 可以用NCBI的远程数据库, 一般与 -db nr
- -evalue 科学计数法,比如说1e3,定义期望值阈值。E值表明在随机的情况下,其它序列与目标序列相似度要大于这条显示的序列的可能性。 与S值有关,S值表示两序列的同源性,分值越高表明它们之间相似的程度越大
E值总结: 1.E值适合于有一定长度,而且复杂度不能太低的序列。2. 当E值小于10-5时,表明两序列有较高的同源性,而不是因为计算错误。3. 当E值小于10-6时,表时两序列的同源性非常高,几乎没有必要再做确认。
与联配计分相关参数: -gapopen,打开gap的代价;-gapextend, gap延伸的代价;-penalty:核酸错配的惩罚; -reward, 核酸正确匹配的奖励;
结果过滤:-perc_identity, 根据相似度
注 BLAST还提供一个task参数,感觉很有用的样子,好像会针对任务进行优化速度。
第三步:运行blast,调整输出格式。
我随机找了一段序列进行检索
echo '>test' > query.fa
echo TGAAAGCAAGAAGAGCGTTTGGTGGTTTCTTAACAAATCATTGCAACTCCACAAGGCGCCTGTAATAGACAGCTTGTGCATGGAACTTGGTCCACAGTGCCCTACCACTGATGATGTTGATATCGGAAAGTGGGTTGCAAAAGCTGTTGATTGTTTGGTGATGACGCTAACAATCAAGCTCCTCTGGT >> query.fa
用的是blastn
检索核酸数据库。最简单的用法就是提供数据库所在位置和需要检索的序列文件
blastn -db BLAST/TAIR10 -query query.fa
# 还可以指定检索序列的位置
blastn -db BLAST/TAIR10 -query query.fa -query_loc 20-100
# 或者使用远程数据库
blastn -db nr -remote -query query.fa
blastn -db nt -remote -query query.fa
以上是默认输出,blast的-outfmt
选项提供个性化的选择。一共有18个选择,默认是0。
0 = Pairwise,
1 = Query-anchored showing identities,
2 = Query-anchored no identities,
3 = Flat query-anchored showing identities,
4 = Flat query-anchored no identities,
5 = BLAST XML,
6 = Tabular,
7 = Tabular with comment lines,
8 = Seqalign (Text ASN.1),
9 = Seqalign (Binary ASN.1),
10 = Comma-separated values,
11 = BLAST archive (ASN.1),
12 = Seqalign (JSON),
13 = Multiple-file BLAST JSON,
14 = Multiple-file BLAST XML2,
15 = Single-file BLAST JSON,
16 = Single-file BLAST XML2,
17 = Sequence Alignment/Map (SAM),
18 = Organism Report
其中6,7,10,17可以自定输出格式。默认是
qaccver saccver pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore
简写 | 含义 |
---|---|
qaccver | 查询的AC版本(与此类似的还有qseqid,qgi,qacc,与序列命名有关) |
saccver | 目标的AC版本(于此类似的还有sseqid,sallseqid,sgi,sacc,sallacc,也是序列命名相关) |
pident | 完全匹配百分比 (响应的nident则是匹配数) |
length | 联配长度(另外slen表示查询序列总长度,qlen表示目标序列总长度) |
mismatch | 错配数目 |
gapopen | gap的数目 |
qstart | 查询序列起始 |
qstart | 查询序列结束 |
sstart | 目标序列起始 |
send | 目标序列结束 |
evalue | 期望值 |
bitscore | Bit得分 |
score | 原始得分 |
AC: | accession |
以格式7为实例进行输出,并且对在线数据库进行检索
blastn -task blastn -remote -db nr -query query.fa -outfmt 7 -out query.txt
head -n 15 query.txt
如果想输入序列,增加对应的格式qseq, sseq
blastn -query query.fa -db nr -outfmt ' 6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send qseq sseq evalue bitscore'
对已有序列进行注释时常见的best hit only模式命令行
blastn -query gene.fa -out gene.blast.txt -task megablast -db nt -num_threads 12 -evalue 1e-10 -best_hit_score_edge 0.05 -best_hit_overhang 0.25 -outfmt "7 std stitle" -perc_identity 50 -max_target_seqs 1
# 参数详解
-task megablast : 任务执行模式,可选有'blastn' 'blastn-short' 'dc-megablast' 'megablast' 'rmblastn'
-best_hit_score_edge 0.05 : Best Hit 算法的边界值,取值范围为0到0.5,系统推荐0.1
-best_hit_overhang 0.25 : Best Hit 算法的阈值,取值范围为0到0.5,系统推荐0.1
-perc_identity 50 : 相似度大于50
-max_target_seqs 1 : 最多保留多少个联配
仅仅看参数依旧无用,还需要知道BLAST的Best-Hits的过滤算法。假设一个序列存在两个match结果,A和B,无论A还是B,他们的HSP(High-scoring Segment Pair, 没有gap时的最高联配得分)一定要高于best_hit_overhang
,否则被过滤。如果满足下列条件则保留A
- evalue(A) >= evalue (B)
- score(A)/length(A) < (1.0-score_edge)*score(B)/length(B)
搭建网页BLAST
曾经的BLAST安装后提供wwwblast用于构建本地的BLAST网页工具,但是BLAST+没有提供这个工具,好在BLAST足够出名,也就有人给它开发网页版工具。如viroBLAST和Sequenceserver, 目前来看似乎后者更受人欢迎。
有root安装起来非常的容易
sudo apt install ruby ncbi-blast+ ruby-dev rubygems-integration npm
sudo gem install sequenceserver
数据库准备,前面步骤已经下载了拟南芥基因组的FASTA格式数据
sequenceserver -d /到/之前/建立/BLAST/文件路径
然后就可以打开浏览器输入IP:端口号使用了。
Sequenceserver高级用法
开机启动:
新建一个/etc/systemd/system/sequenceserver.service
文件,添加如下内容。注意修改ExecStart.
[Unit]
Description=SequenceServer server daemon
Documentation="file://sequenceserver --help" "http://sequenceserver.com/doc"
After=network.target
[Service]
Type=simple
User=seqservuser
ExecStart=/path/to/bin/sequenceserver -c /path/to/sequenceserver.conf
KillMode=process
Restart=on-failure
RestartSec=42s
RestartPreventExitStatus=255
[Install]
WantedBy=multi-user.target
然后重新加载systemctl
## let systemd know about changed files
sudo systemctl daemon-reload
## enable service for automatic start on boot
systemctl enable sequenceserver.service
## start service immediately
systemctl start sequenceserver.service
nginx反向代理:我承认没有基本的nginx的知识根本搞不定这一步,所以我建议组内使用就不要折腾这个。简单的说就是在nginx的配置文件的server部分添加如下内容即可。
location /sequenceserver/ {
root /home/priyam/sequenceserver/public/dist;
proxy_pass http://localhost:4567/;
proxy_intercept_errors on;
proxy_connect_timeout 8;
proxy_read_timeout 180;
}
假如你有docker的话
# ubuntu
docker run --rm -itp 4567:4567 -v /path-to-database-dir:/db wurmlab/sequenceserver:1.0.11
# centos
docker run --privileged --rm -itp 4567:4567 -v /path-to-database-dir:/db wurmlab/sequenceserver:1.0.11
注意,你得在宿主机器上/path-to-database-dir
建好blast索引,或者用docker exec -it docker容器名 /bin/bash
进入到容器里,用sequenceserver -d db &
运行
参考资料:http://www.sequenceserver.com/doc/
术语列表
引自BLAST Glossary
参考资料
- Linux系统中NCBI BLAST+本地化教程
- BLAST Command Line Applications User Manual
本文还可在http://xuzhougeng.top/阅读
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