Week 1 Transcription and Assays-Mechanism of Bacterial Transcription

别人的笔记http://mooc.guokr.com/note/19064/

Lecture 1: Transcription and Assays

Segment 1: Introduction to Transcription

研究转录需要搞清：RNA聚合酶如何识别基因（特异性）和一个基因该以什么频率进行转录（效率）。

第一部分分子生物学原理内容回顾

A promoter is the site that directs RNA polymerase to bind a gene. The transcription start site is usually at the downstream end of a promoter. A transcript encodes a protein, which requires that the translation start and termination sites must be within the area defined by the transcription start and termination sites.

Segment 2: Requirements for Transcription

双链ＤＮＡ模板。模板链指导ｒＮＴＰ　的合成，非模板链不指导。

Segment 3: Assaying Transcription - Incorporation Assay

分析转录本。使用标记过的ｒＮＴＰ掺入以分析，所以叫Incorporation。其中有两个问题：

１.　把ＲＮＡ产物从标记的ｒＮＴＰ中分离出来：滤纸结合分析法（不能提示长度信息也不能确切定位转录起始位点）和凝胶电泳（根据产物的大小，如果是几百核苷酸的 可以用琼脂糖胶；或如果产物更小，可以是丙烯酰胺凝胶；通过加入尿素防止ＲＮＡ的折叠）
２.　虽然起始点精确，但终止点不精确：为解决这一问题就可以在体外做 transcription runoff assay，失控转录分析，就是有一个限制酶切位点使得聚合酶在模板末端脱落，从而使得终止点相同。

Segment 4: Transcription Start Sites - Primer Extension引物延伸 1

测定转录起始位点的第一种方法：引物延伸实验。

1. 抽提RNA
2. DNA探针。要有荧光标记 可以标记dNTPs or the DNA primer、DNA primer引物需要20-25个核苷酸的长度。
3. 杂交
4. 延伸引物，使用逆转录酶。当它延伸到转录起始点的时候会脱落。使用逆转录酶最好采用RT isolated from a virus infecting thermophilic bacteria and reverse transcribed at 60°C，因为高温会移除RNA中可能的二级结构，是的逆转录酶在RNA的末端终止。
5. 使用丙烯酰胺凝胶分离

TSS就是要测定的转录起始位点 transcription start site

Segment 5: Transcription Start Sites - Primer Extension 2

一个例子。TSS（Transcription Start Sites）永远位于Translation Start Sites(也称为start codon)的上游（即5‘端）。引物为61-81之间的长度，引物增长后再TSS位置处断裂，发现是192个长度。

           ------------------------111 bases from TSS to Start Codon
           -----------------------------------------  192bases 

                                     0   61---------81 DNA PRIMER
         5‘----------------------------------------------------------------- RNA  3
          |                          |               |
         TSS                       Start        Position of
                                     Codon      the Primer

Segment 6: Gene By Gene Expression - Reverse Transcriptase-PCR

检测单基因表达量最常用的方法。在逆转录反应中引入PCR

Segment 7: Gene By Gene Expression - Real Time-PCR

用一种能与产物双链DNA结合的染料，你就能看到染料越来越浓，颜色变深体现了产物生成过程。但是需要设置对照组，比如看管家基因actin的表达量，以排除掉污染。

Segment 8: Global Transcription - The Process of RNA-Seq

前面的方法只能研究一个基因，下面介绍全测序的方法，RNA-Seq

cDNA: copy DNA(complementory DNA)。由mRNA逆转录而来，接下来进行扩增、剪切、测序。

Segment 9: Global Transcription - The Data of RNA-Seq

Segment 10: Global Transcription - GRO-Seq 1

Global run on seq
GRO-seq是观察单个基因转录速率最直接的方法

Segment 11: Global Transcription - GRO-Seq 2

优点是会获得正在进行的转录信息

Lecture 2: Mechanism of Bacterial Transcription

Segment 1: The Structure of 细菌的RNA Polymerase聚合酶

Segment 2: The Activity of RNAP（RNA聚合酶的核心部分） and RNAP(holo)

RNAP需要一条DNA和一个缺口才工作、非特异的。

而RNA聚合酶的第五个亚基决定了特异性。叫做σ因子，可以识别启动子序列。σ因子+RNAP=全酶RNAP(holo)。

RNAP(holo)可以从启动子开始转录而RNAP不能。

Segment 3: Anatomy 解剖of a Bacterial Promoter启动子

RNA通过启动子的功能部件贴到DNA上

启动子的构成

Segment 4: Mapping Bacterial Promoters

The promoter mapping strategy follows the same principal as the replicator mapping strategy you learned in 7.28.1x. Because the promoter will be adjacent to the transcription start site, the first step is to map the transcription start site, which one could do using a primer extension assay. Next you mutagenize suspected regions of importance and then assay the mutants for function. Loss-of-function indicates an integral part of the promoter. Crosslinking sigma to DNA would be a step of a ChIP protocol.

检测突变的实验：promoter fusion assay。把启动子融合到一个产物蛋白质很容易被检测的基因上，比如GFP(发绿光）或者LacZ

promoter fusion assay检测突变从而识别启动子