Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs
Nature Structural & Molecular Biology
Ci Chu, Robert C Spitale & Howard Y Chang
The where: mapping lncRNA-binding sites on the genome
ChIRP使用antisense DNA oligonucleotides 捕获纯化lncRNA–chromatin 复合体。基于优化特定RNA检索的考虑，ChIRP使用特定RNA杂交所需的变性条件，依靠化学交联、超声和地毯式寡核苷酸探针捕捉剪切RNA分子的所有部分。
与ChIRP类似的技术有CHART和RAP，三者大致流程基本相同，主要是寡核苷酸探针不同。选择探针的主要挑战不清楚lncRNA哪一段具有可接近性。ChIRP和RAP不需要提前明确lncRNA和染色质相互作用的结构域，二者均使用寡核苷酸分布在整个靶RNA上，以便充分利用所有潜在的杂交点。通常在染色质制备过程中，lncRNA会像染色质一样，被剪切成数百个核苷的小片段，而ChIRP和RA通过利用地毯式的探针，可以确保捕获所有RNA片段。相比之下，ChIRP使用的是20nt探针，价格便宜，生物物理上提供了对非目标的最佳识别，而RAP使用了更长时间的探针 (120nt)，合成的成本要高得多。CHART方法较复杂，先用探针杂交，然后用RNase H消化，由于双链被保护，使得与DNA杂交的RNA被保存下来。应用这种方法耗费时间，但可以找到假定的结合位点，并且信噪比较低。
交联方法：戊二醛、甲醛。对于长交联，戊二醛、戊二酸二异辛酯DSG更适合
ChIRP：chromatin isolation by RNA purification
Chu, C., Qu, K., Zhong, F.L., Artandi, S.E. & Chang, H.Y. Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions. Mol. Cell 44, 667–678 (2011).
CHART：capture hybridization analysis of RNA targets
Simon, M.D. et al. The genomic binding sites of a noncoding RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 20497–20502 (2011)
RAP：RNA antisense purification
Engreitz, J.M. et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome. Science 341, 1237973 (2013)
Hacisuleyman, E. et al. Topological organization of multichromosomal regions by the long intergenic noncoding RNA Firre. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 198–206 (2014).探针长度
116HG
Powell, W.T. et al. A Prader-Willi locus lncRNA cloud modulates diurnal genes and energy expenditure. Hum. Mol. Genet. 22, 4318–4328 (2013)
FISH探针http://www.ebiotrade.com/newsf/2017-4/2017419170616642.htm
The what: identifying the lncRNA-bound proteome
不是每个LncRNA与染色质相互作用，但几乎每一个lncRNA都通过招募蛋白质发挥作用。因此
LncRNA结合蛋白组的鉴定是理解LncRNA功能的核心。
常规方法：使用lncRNA全长探针，或者使用已经明确的与RNP结合的lncRNA部分全长探针。捕获的蛋白产物通过MS或者其他方法鉴定。主要缺点：采用全长探针后，其浓度、二级结构并非生理情况下状态，导致出现错误结果。其二，裂解后出现的RNA-蛋白假性互作也可能导致假阳性。可以通过直接在RNA上使用基因标记亲和性片段的方法来规避这种问题，如naturally occurring RNA sequences that bind strongly to the bacteriophage MS2 viral coat protein2（不懂如何在lncRNA上标记一个MS2 viral的外壳蛋白？）
标记的rna及其结合因子可以用固定在固体载体上的亲和蛋白纯化。与RNA色谱法相比，标记的转录本在体内转录，因此更有可能与内源性转录本暴露在相同的生化环境中。实例：两个RNA适配子标签串联插入到7SK小核RNA中，此方法成功从细胞中纯化出7SK相关蛋白复合物。尽管有明显的优势，用外源序列标记RNA是很费力的，甚至可能干扰其内源结构和功能。需要对RNA有深入的了解才能决定如何安放标签，而且由于标记的RNA通常在自然条件下进行纯化以保持其相互作用，因此该方法也易于检测裂解后的互作。
使用ChIRP类似的探针法可以捕获RNP。TERC和let7的相关实验就是采用的非变性条件下的探针法。采用oligo dT探针可捕获有polyA尾的mRNA——采用UV交联，可以更加严格的清洗。类似ChIRP的方法有PIch法。
ChIRP-MS法的优势：以Xist为例。Xist长度极长，与核基质接触紧密。超声可以增加其溶解性，但不可避免的导致其在超声过程中被打成片段。此时标签法变得无用，而使用地毯式的探针则可以捕获其每一个片段。
由于蛋白质不能被现有技术扩增，导致in vivo捕获RNA-RNP复合物所需的细胞或者组织量很大。在RNA本身拷贝数较低的时候，对细胞或者组织的需求量较大，否则MS很有可能鉴定出许多非特异性蛋白。在某些极端情况下，如lncRNA表达量极低，导致MS效果很差的话，可以采用蛋白芯片法（包被有RNP的全长蛋白或者其短截体）或者可使用SILAC技术预先标记肽段，提高MS分辨率。对于蛋白芯片法，则采用体外合成的、带荧光的RNA全长探针，通过结合后是否具有荧光的方法，in vitro先筛选出目的蛋白。
裂解后出现的RNA-蛋白假性互作
Riley, K.J., Yario, T.A. & Steitz, J.A. Association of Argonaute proteins and microRNAs can occur after cell lysis. RNA 18, 1581–1585 (2012).
116HG
Powell, W.T. et al. A Prader-Willi locus lncRNA cloud modulates diurnal genes and energy expenditure. Hum. Mol. Genet. 22, 4318–4328 (2013)
TERC和let7
Schnapp, G., Rodi, H.P., Rettig, W.J., Schnapp, A. & Damm, K. One-step affinity purifcation protocol for human telomerase. Nucleic Acids Res. 26, 3311–3313 (1998)
Hutvágner, G., Simard, M.J., Mello, C.C. & Zamore, P.D. Sequence-specifc inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2, E98 (2004).
Oligo dT捕捉
Baltz, A.G. et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profle on protein-coding transcripts. Mol. Cell 46, 674–690 (2012).
Castello, A. et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNAbinding proteins. Cell 149, 1393–1406 (2012)
PIch: proteomics of isolated chromatin segments
Déjardin, J. & Kingston, R.E. Purifcation of proteins associated with specific genomic loci. Cell 136, 175–186 (2009)
RNA-RNA interactions
采用ChIPR法，发现TINCR可以结合并调节许多皮肤发育相关的mRNA，从而调控上皮分化。
由于ChIRP使用化学交联，它不能区分直接RNA-RNA杂交的结果是否存在蛋白质的介导。相比之下，CLASH技术采用紫外交联，这种技术只能捕获RNA分子之间的直接碱基配对。例如，CLASH揭示了microrna及其同源mRNA的直接配对。与ChIRP一样，CLASH可以用于研究分子间相互作用和分子内结构。
TINCR:
Kretz, M. et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature 493, 231–235 (2013).
The how: probing and analyzing RNA structure
讲了许多检测lncRNA二级、三级结构的技术。最早用RNase的方法，之后xxx。其中SHAPE较为新颖。Genome-wide的RNA二级结构分析发现，一些SNP可以影响lncRNA二级结构。
RNA-protein interfaces
CLIP技术以蛋白质为核心，描述单个RNA-RNP的互作结构。RNA-MITOMI可简单认为高通量的CLIP技术
Technological breakthroughs in other areas aid lncRNA research
新技术主要有原位RNA测序，高分辨率原位RNA-RNP复合物现象，CRISPR技术以及生信等。
Merging biological insights to design lncRNA function