原贴地址：https://blog.csdn.net/joshua_hit/article/details/54982018
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ChAMP/inst/doc/ChAMP.html
1. 摘要
我目前的研究领域是DNA甲基化，这个领域并没有很好的分析软件，顶多一些R包吧，而且很多学生物的人，想要分析DNA甲基化数据并不容易，虽然这样一些包已经存在的，但是首先，他们不一定易用，例如minfi（我领域第一号分析包），开发人在写的时候，就已经默认使用者有相当的R语言知识和统计知识。其次是，包的功能分散，并 不集中，经常需要从一个软件跑出来的东西，弄来弄去导入到其他软件中去进行下一步分析。
我在英国留学的时候，遇到了ChAMP包的原作者，她已经不想再管这个软件了。所以我接手了，在用了一段时间之后，我实在感觉这个包没法用……所以将其升级了一下。用到了Shiny和Plotly两个我超级喜欢的R工具。
目前最新的软件已经发布在了Bioconductor上。我也负责回答有关于这个软件的所有问题，处理bug，帮助全球科学家做分析等等。不过个人觉得，写这个软件也算是一个小工程问题。
先上一张图：
这就是最后的R包运行结果。其中的GUI展示窗口。Shiny并不是什么很新的技术了，我很喜欢。只需要几行代码，就可以形成一个上述的网站，非常有用，其中还可以有动态控件让用户调控参数。后台的接入其实就是普通的R程序，你要是有txt文件，可以直接读取进来；你要是有数据库，可以用RSQLite等包从数据库里直接调用……完全不受限制。另一个很好用的工具是Plotly。这个工具有很多语言的接口，我纯粹使用了它的R语言接口而已，效果是非常好的，直接生成了可交互的图片。对于R语言熟悉的同学，用会这两个包不会太久。
我之所有用这个办法写了这个包有几个原因：
首先这个包毕竟还是用来帮助科学家研究DNA甲基化数据的，并不是什么用于Visualization的花壳子，后边的统计分析严谨认真，也是我研究领域一个小有名气的软件了。
其次，科学家对于可视化绝对是有要求的，且不说图片能不能达到文章要求，但是可交互的图片，可调整的参数，可以节省人们大量的时间。
第三，有人问我为什么不像很多人一样，做网页数据库，让用户上传数据，然后再后台运算分析（这是科研届太常见的一种模式）？我的回答是，生物数据太大，一批数据如果有500个以上样本，上传都要好久，我也不知道怎么搞到那么大内存的服务器？也不知道如果很多人同时上传会不会有问题？而且程序参数众多（整个包参数加起来几百个），有人要调怎么办？所以我最后想到了这个办法——在每个人自己的服务器上实现可视化，本地就可以基于数据生成可交互的网页。这样我不用出钱租服务器，不用考虑数据大小问题，又成功把用户体验做出来了。
2. ChAMP包说明
鉴于这是CSDN博客，我之前写了更多R语言技术，现在还是介绍一些R包背景，也许对于国内做计算生物分析DNA甲基化的同学有一些帮助。、
DNA甲基化指的是包裹在DNA上CG碱基（又叫CpG）的外周的一些蛋白发生变化，进而导致基因或者一些调控因子的表达出现变化，进而导致那些基因或者调控因子控制的表型出现变化，进而导致疾病或者差异的发生。（没错，生物研究就这样，一层关联一层，一层决定一层，非常难研究，比起写一个网站直接用鼠标点点看好不好用难太多了……）。我研究的部分就是上述链条的第一步：DNA最初的甲基化是如何导致基因或者调控因子的表达出现变化的。
正如大家所听闻，测序是目前生物研究的“标配”了。同样科学家也可以把DNA甲基化测出来，然后比较两群人的差异，简而言之：100个癌症病人，100个正常人，把它们每一个人的DNA甲基化测出来，然后比较一下，看看人体那几百万个CpG位点差异如何，哪些有差异。这就是大部分生信人的工作。但是这并不容易，因为统计方法需要学习，数据处理需要学习，如果有杂音需要消除，如果有结果要看相关，如果有相关要看因果……所以，个人觉得，计算生物学（或者生信）做得好的人，绝对在IT和统计界也算高手了。
目前主流的测序方法大概有全基因组测序（whole genome bisulfite sequencing）、我最常用的illumina芯片测序（Microarray-based methods），还有RRBS一类的我不知道怎么翻译成中文……有兴趣的人自己查吧。
我最常用的芯片测序大概覆盖了450,000或者850,000个位点，看你选那种芯片（illumina公司设计的，全球一个标准，谁都改不了……）。也是目前科研届的最主流工具，有点有很多啦——比如便宜，其他不重要。测序完的结果是一种叫做IDAT文件的东西，这就是我程序分析的起点。这样一个文件包含的内容，就是我刚才说的：* 一群人中每一个的体内的450,000或者850,000CpG的甲基化程度。*，科学家要做的，一般来说就是：
1：把它们分开，谁是癌症，谁健康？
2：整理数据，Normalization一类的跟上。
3：开始对两批人的几百万CpG位点进行比较。
4：看比较出来的CpG位点哪些有差异？他们对应到什么疾病或者通路中。(本体论oncology)
OK，简单来说就是这么个流程。实际上很复杂的，如果不复杂，这领域也就没有存在的可能性。
上述是ChAMP包的主要函数和其组成的研究流程。
其中蓝色部分代表的是有关于数据的准备部分，就是说你要先确认数据没问题，如果有问题，你必须停下来，回头找什么问题，如果处理错了重新处理，程序错了该程序，如果实验做错了……你这批几万美元的数据就直接可以报废了。
其中红色部分代表的是数据分析部分，就是说确认数据没问题之后，你可以用它产出结果了，这些函数里都封装着严谨的统计算法，涉及多重线性回归（multiple linear regression）、网络分析（network analysis）、细胞中各类分解（Cell Type Detection）等等。这一些函数大概集中了差不多我领域的所有分析角度了。这就是绝大多数R包做的事情。
其中黄色部门代表数据可视化部分，就是说数据分析已经完了，你可以用它查看分析结果，自动生成可交互，可下载的图片。
箭头指示了分析流程，首先是load数据，然后是QC（quality control），然后是normalization，然后是SVD分析（看有没有batch effect）。准备完毕之后，黑点代表了一批质量有保证，经过处理，可以直接上马进行数据分析的数据了。之后的分析，DMP代表找出Differential Methylation Probe（差异化CpG位点），DMR代表找出Differential Methylation Region（差异化CpG区域），Block代表Differential Methylation Block（更大范围的差异化region区域），RefFree代表细胞差异被修正过后再找的DMP，EpiMod是基于基因作用网络的差异化分析。（看到木有，整个生信研究，就是各种找两群人间的差异……但是真心很不好做。）
3. 程序运行展示
首先通过Bioconductor安装程序，直接在R中输入：
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")biocLite("ChAMP")
安装如果报错很常见，因为我引用了很多其他包，而那些包也用到了很多其他包，偶尔会缺失。只需要认真看一下错误最后几行，会显示出哪个包缺失了，然后重新安装那个就行了。
程序提供了两批测试数据作为演示，一批450K的数据，和一批我自己模拟的850K数据（没错，数据分析程序的开发人自己没有数据用于开发……）。数据在我附带的ChAMPdata包中。
下面开始一套完成的DNA甲基化数据分析流程：
程序过程中会跑出很多中间结果，有些花时间很长，比如几十分钟，测试数据的所有中间结果，都已经存储在了包中，可以用下面代码读取：
data(testDataSet)
比如只对于Shiny或者Plotly感兴趣的同学，可以直接用上面代码读取数据，调到文章后部的GUI程序部分，开始把玩看效果。
3.1 首先是数据Load
下面的testDir指向的是我提供的450K测试数据的地址，champ.load()函数可以直接从目录读取数据，你只需要把illumina机器跑出来的IDAT文件全部解压放在目录下就行了，但是目录下还必须放一个有关于样本信息的csv文件，也是illumina机器产生的，这很重要。程序再智能，一开始的这点小要求还是必须要满足的。
testDir=system.file("extdata",package="ChAMPdata")
myLoad <- champ.load(testDir,arraytype="450K")
如果是自己的文件，那么需要把所有的idat和csv文件，放在一个文件夹里面，然后R的工作目录定义到该文件夹(自定义为AA）
myLoad <- champ.load(directory="AA", arraytype="450K")
这样就把数据全部读入了，其中会做一部分检测，比如低质量的CpG位点，也会做一些过滤，比如位于性染色体上的CpG位点会被删掉，比如SNP位点（就是基因突变位点）附近的CpG位点会不稳定等等……详细原因算法我就不多说了，说起来没完没了，一个原因就是一两篇论文。
然后我提供了一个小程序CpG.GUI来看一下你这批数据的所有CpG的分布。这个小程序是我一开始学习Shiny和Plotly的时候测试代码，一直留下来了。这也是所有GUI里最简单的一个，最适合用于分析代码结构，效果如下：
显示的东西都是，你数据的CpG位点是如何覆盖的，比如第一张图（左上）是所有CpG在染色体上的分布，等等……代码太长，而且不易读（不是我的错，Shiny这个框架写东西缩进空格太多，结构类似于HTML那种。） 大家可以看Github。
3.2 下一步做的是Quality Control
代码如下：
QC.GUI(beta=myLoad$beta,arraytype="450K")
然后会出现一系列的图像：
会有一个网页自动打开，其中有几个tab，每一个tab代表了一些分析图像，用户可以点击那些tab，每一次转到一个图像上，需要等待几秒钟，后台在计算，计算完毕后，图像会自动生成。图像用的是plotly，可交互，鼠标放上去会有显示。
这一个函数的功能是告诉用户，
tab1: 样本之间的Clustering情况是怎样的？
tab2: 测序芯片上的两种测序技术（Type-I和Type-II）之间差异如何？
tab3: 所有样本的分布式怎样的？
tab4: 根据当前数据进行了层聚类树状图是怎样的。
tab5: 这批数据中差异性最大的一批CpG的热力图。
3.3 然后做的是Normalization
Normalization就是为了把上面的tab2里的两种测序方法得到的数据不一致现象消除，否则如果你通过分析函数知道CpG有差异，你如何知道这个差异是疾病带来的？还是测序方法差异带来的？这一部至关重要，现在已经有很多方法用于完成这个问题，还有科学家在乐此不疲地开发更多算法完成这一步。
myNorm <- champ.norm(beta=myLoad$beta,arraytype="450K",cores=5)
规则化之后的结果是显而易见的，type2-BMIQ是规则化之后的分布曲线，和红色的已经一致了，所以测序方法上的差异，不会导致结果出现问题。
3.4 然后做的是SVD
这个分析讲真很简单，但是确实很有用，算法一句话形容就是：把数据进行SVD分解，查看Component有没有与某些重要的Factor相关。SVD大家都知道，主成分分析第一步就是SVD，其性质类似于把重要的Component给找出来了。而与Factor的相关，可以告诉使用者，你的数据中的大部分差异，是又你想研究的因素（比如癌症、疾病、年龄等等）导致的，还是由你不想研究的东西，比如样本的种族、数据产出的研究所等等一些无关痛痒的东西决定的。如果是后者，那很不幸你的数据质量也不高……
champ.SVD(beta=myNorm,pd=myLoad$pd)
比如上述我这批测试数据的结果就非常好：因为数据中的差异，显著与样本的PhenoType互相关联。换言之，你如果做针对Sample_Group（就是Cancer和Normal）的分析，得到的结果就是由于疾病导致的。
额外提一句，如果数据与其他无关的东西相关，而与你想要研究的东西不相关，那么你就需要想很多办法了，比如，如果上述的图片中，红色那个板块（显著相关的意思，越红越相关）是在Array那一行，而不是在Sample_Group那一行，那就意味着你的数据中的差异更多是Array导致的，而Array是芯片中的样本排列方式，换言之就是……你的实验不够好。但有些问题很难避免，比如你的100个病人年龄不同很正常，老人身体上自然会有一些弱化，年轻人可能更好，样本的年龄很自然地会引入一些误差。
上述这种情况一旦遇到是非常痛苦的，至今也有很多我领域的人在研究如何把这样的错误修正，如何矫正数据等等。我程序集成了一个别人写好的用于修正这一类错误的函数Combat()。我个人觉得效果一般，而且时间非常非常非常长（该测试数据只有8个样本，要跑一个半小时！）。但是似乎也没有更好的办法……
如果想要用我程序集成的函数，用如下代码修正：
myCombat <- champ.runCombat(beta=myNorm,pd=myLoad$pd,batchname=c("Array"))
1
3.5 寻找差异化CpG
如果上述步骤都能完成，说明你的数据质量是挺好的，可以分析了！最简单，但同时最重要的一种分析就是差异化CpG，正如我之前说的，这个步骤的目的就是，找出几百万CpG中的哪些在疾病中发生了变化，而这些变化又是如何导致了基因发生了变化，最终导致了人体生病。而做的方法直观上简单的可怕：
你有100个癌症病人，100个正常人，每个人身体中都有450K个CpG的位点在测序出来，针对其中的每一个CpG，你都有200个数据对不对？如果这一个CpG在100个正常人中和100个癌症病人中的甲基化水平都差不多，你还会继续怀疑它吗，当然不会！
但如果，你的100个癌症病人普遍在这一个CpG上的甲基化水平高（不太严谨但是很形象地说，就是DNA那个CpG的序列外层越来越多的部分被甲基附集上去了），而那100个普通人的甲基化水平不高，那这个位点就很有嫌疑了对吧。
为什么需要一定量的样本，比如100个？因为如果你只找两个人，一个德国人一个中国人，那个德国人高，那个中国人矮，你能因此就说德国人在人种上比中国人高吗？当然不能……但如果你找到100个德国人，在找到100个中国人，比较以后，就比较可信了，这涉及t.test()里的power的问题。
这就是做研究的艰难：你得找到100个病人，让他们同意治疗，然后耗资几万几十万完成测序，有了数据还要祈祷实验员没有点错试管，数据下来了如果由于年龄、人种等原因，数据差异已经找不到了，你还得想办法修正这些问题，然后你可以开始比较，从几百万位点（基因、SNP、CpG都一样）中找出那些可能有关系的……等你做完这一切，可能一两年已经过去了，而你本科毕业就进入IT界的同学可能已经工资两万多了，这还绝对算是科研中很快节奏的项目了，所以我觉得社会真的应该给科研工作者更多尊重，做最难的活，拿最低的工资。
代码如下：
myDMP <- champ.DMP(beta = myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group)
我的程序函数之间的接口是设计过的，就是说，你从上一步跑出来的程序，可以自动被下一步识别到（当然你要是改名字什么的那就找不到了，只能自己在参数中设定）。完成这一步以后，就找出了几百万位点中可能有问题的。做这一步我最讨厌的就是：有时候一把跑出来，几百万位点中，几万甚至十几万都是显著的（做年龄的时候就这样，因为年龄对于人身体的影响太大，可谓是全方位无死角的）！
然后是整个包中的最复杂的GUI函数：
DMP.GUI(DMP=myDMP,beta=myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group)
DMP.GUI(DMP=myDMP[[1]],beta=myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group)
会出现一个稍微复杂一点的网页，如下：
这个页面左边，是一些可以调控的参数控件。比如你可以选择你想要的位点的p value等等，然后你点击Sumbit，右边就会出现通过了参数筛选的所有CpG的信息。这比起以往的方法方便太多了。
然后如果你选择第二个Tab，会出现另一个界面(自动的)。
第二个tab是前一个页面的所有显著CpG的热烈图。每一行是一个位点，每一列是一个样本，可以很明显地看出，通过统计分析找到的人体中几百万CpG位点中最显著差异的那些位点，在癌症和正常人的甲基化水平完全不同。
第三个tab如下：
这个中的三个柱状图是所找到的显著CpG的分布，和之前的CpG.GUI类似。这张图充分证明了Plotly的强大，每一个柱子上有三个bar条对吧，你可以点击右边的legend把它关掉。
下一张是整个R包实现起来最复杂的一个页面：
用户可以直接输入基因的名字来选择你们想要查询的基因，看这些基因里是不是收到了”癌变CpG“的影响。比如，在图中的左侧输入NFIX，点击Submit，右侧需要计算十秒钟左右，然后上边会显示出这个基因中显著差异CpG。下面会显示出基因的不同区域，比如是基因开始，还是在基因后端一类的。我例子中这个基因，有大约十多个CpG位点，而且这些位点无一例外有显著差异，所以基本可以确定这个基因与癌症关系有关系。（但是具体关系是什么很难确定，谁导致了谁（因果）都不一定，这就必须要去实验室点试管做实验才能知道了。），在下方，我用R语言爬网站的技术，抓去了这个基因在一个比较权威的数据网站wegene的信息，这样的话，用户一下点击，就可以同时看出分析图和基因说明，而不用再去查网页看这个基因是干嘛的。
抓取网页的代码如下：
webpage <- tags$iframe(src=paste("https://www.wikigenes.org/e/gene/e/",MatchGeneName[which(MatchGeneName[,1]==Gene_repalce()$genename),2],".html",sep=""),width="60%",height="100%")
不过还需要在plotly中调用htmlOutput()函数创建一块用于网页展示的空页。详细的还是看代码吧……
基本上这样的图，已经足够发表文献了，直接点击右上角下载，就可以作为论文图片的，所以软件发布以后，很多人都说很方便，这也让我比较开心，我没水平做出解决癌症的方案，疗法，至少可以让全球攻坚这方面的人做得更快更舒心一些吧。
之后的一个tab是：
图片上半部是根据tab1选择出的显著CpG针对基因的富集情况做的排序图。（否则人体中有两万多基因，用户怎么知道应该在上一个tab搜索哪一个呢？）下图就是一个最简单不过的boxplot，但是它依然是目前科研届最常见最有用的图。用户可以选择左边的cpg来选择想要查看的CpG。
有些需要做羟甲基化的，可以使用下面代码：
myDMP<-champ.DMP(beta=myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group,compare.group=c("oxBS","BS"))
# In above code, you can set compare.group() as "oxBS" and "BS" to do DMP detection between hydroxymethylatio and normal methylation.
hmc <- myDMP[[1]][myDMP[[1]]$deltaBeta>0,]
# Then you can use above code to extract hydroxymethylation CpGs.
3.6 寻找差异化区域
Differential Methylation Block(DMB) 和 Differential Methylation Region(DMR)这两个概念是之前的科学家提出来的，就是因为找单一的CpG已经不够显著了！比如一个基因跨距几千位点，通过上一步分析，就一个CpG有问题，你算他有问题吗？这就是一个比较尴尬的问题……所以有的科学家就觉得，单一CpG影响可能不可靠（感觉上有点像木村资生的中性理论，觉得有些位点为人太随意了，而有些真正受重大影响的基因，其实他们的基因序列上会受到一系列的暴击伤害—— 一连串的CpG都会出现很明显的差异，既然这样，我们就专注于研究那些比较要紧的基因吧，有些暂时看不出来的就不管了，比如那些零零散散的差异CpG就当它不存在吧。
所以，比如先用代码：
myDMR <- champ.DMR(beta=myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group,method="Bumphunter")
上面是我写的DMR函数，其中集成了三个方法，DMRcate,Bumphunter，和我自己写的ProbeLasso。至于谁好……互相都说自己是最好的，经过我之前用模拟数据的评测，Bumphunter比较可靠，精确度可以有90%以上，ProbeLasso才有75%左右吧，DMRcate是我后来集成进去的，没有评测过。
然后我们可以用DMR的GUI函数查看一下结果（有三个tab，我只放最重要的那个）：
输入代码以后，估计需要等待大约20-30秒，那一段时间，程序正在后台完成Mapping，把找到的CpG匹配到全基因组上。然后就可以像之前的那个DMP.GUI一样操作了。图中可以看出，DMR就是一个连续不断都比较长的差异片段，科学家们觉得，这样的连续差异片段，对于基因的影响会更加明显，只找这样的片段，可以使得计算生物学的打击精度更为准确，也可以让最终找出来的结论数据更少，便于实验人员筛选。
而其实找出来以后，差别就不大了，你依然需要把这一些区域Mapping到基因组上，找到对应的基因，然后该做什么继续做，又回到普通的比较模式了。这个网页的其他两个tab自动完成了匹配，这就是一些很简单的匹配工作而已，不过毕竟省了一些时间。
另外一个类似的东西就是DMB，那个东西出现的原因是，有的科学家觉得，DMR这样的区域还不够显著，DNA上的甲基化出现变化，可能是绵延几千位点的！而且只会在基因以外的区域，但是这些基因以外的区域发生变化，却会导致基因的表达发生变化。你可以想象成，北京周边的河北在大炼钢铁，然后北京也跟着雾霾了，大概就是这意思。
我个人对这种假设还是有点怀疑的……根据这个提出这个理论的作者的文章，他通过找到这种Block之后，将它与一些癌症形状进行了correlation，结果是显著的，然后这种理论大概就有了，相应的算法也出现了，虽然并没有见到这样的算法确实找到了某些重要的生物突破，但是身为这方面的人，我也不得不实现了他这个算法，放在这里供用户使用。
我个人觉得correlation出来的结果，距离因果还是有很大距离的。建立在Correlation上的假设理论，甚至算法，实在是有点怀疑它的统计power。
我感觉得做计算生物很大一个问题就是不要统计过度，比如我根据相关性得出一些结论，我在用这批结论去做另一个聚类或者相关，在得到一个统计值结论。这样的power减弱的很快啊。你做一次统计，错误率可能只是20%，那么根据其结果再错一次统计，错误率就会上升到 1-80%*80%=36%！除非在一次统计过后，用相对严格的标准去筛选统计值，也许有助于这种情况好转。
Differential Methylation Block的代码和图都不展示了，程序的Vignette里边有。
3.7 寻找作用通路网络中的疾病关联小网络
这货根本就没有中文译名，上边是我自己翻译的。简而言之就是，人体内的作用网络实在是太多了，几百几千吧，每一个都涉及了一系列基因。这就是过往的科学家研究出来的，比如某个通路会导致头疼，然后有几百个蛋白（及其背后的基因）都是通过共同作用导致了这一场头疼的。但是如果你头疼，不见得是所有这些基因都出了问题，而是可能其中的某一部分，甚至于只有一两个出了问题。所以你就可以基于已经存在的那个网络，再集合数据，找出哪些网络可能出问题了？或者是这些大网络中的哪些基因具体除了问题。
这个功能很重要，否则做完上边几步，用户只会知道那些基因有问题，至于他们之间有没有关系，是不是会同时作用于某些网络，就没法知道的了。但其实也不复杂，只需要自己写个程序，匹配一样基因和网络就完了，只不过数据的准备啊，洗啊，匹配啊，也是够烦的，所以这个函数就提供了全套的分析。
myEpiMod <- champ.EpiMod(beta=myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group)
上述代码之后可以输出一些图片到当前目录的文件夹下：
其中的颜色代表了基因的甲基化上下调的趋势。（人们得了某个病，不一定是导致那个病的基因高表达了，也有可能是抑制那种病的某个基因低表达了，甚至于可能是抑制那个抑制生病的基因的基因突然高表达了，这可以无穷下去……）。所以一个网络了，不见得都是同样的表达趋势，蓝点代表甲基化高表达，而黄点代表低表达。一言以蔽之，可能是这个网络中的这一些基因”同谋“导致了你在研究的这个疾病发生了。
3.8 拷贝数变异
这个的意思就是可能你的测序数据里，表现出某些疾病导致的原因，是有些基因片段被复制的此处过多或者过少。检测方法很聪明，基因人们是看不见的，但是测序的原理，是用一些片段去把与CpG有关的片段”粘“下来。然后对这些片段进行测序。一般来说，我是不关心粘下来多少的，因为我研究的基因的甲基化水平，其实就是某一个为点的被甲基化和未被甲基化水平的比例。例如，假设正常的情况下，某个CpG所在片段会被”粘“下来一万次，其中8000片上的CpG都没有被甲基化，而2000片被甲基化了。那么最后到我手里的数据，就是这个CpG的甲基化值为2000/8000=0.25。如果被粘下来两万次，那么必然是16000片上没有被甲基化，而4000片上被甲基化了，我得到的比例还是0.25。完全感觉不到区别啊！
所以检测办法，就是去看，到底多少片被拉下来了，然后与正常人作比较。这个函数不是我写的，是以前一个教授，但是我觉得有点粗糙，因为它只能统计出每一条染色体上的拷贝数变化差异，我觉得这不够的。如果有机会，我希望更新一下程序，让它打击更为定点，就是找出来是哪些CpG发生了突变导致了拷贝数变异，然后与其他的指标，比如表达值一类的作比较，这样应该会有新发现。
myCNA <- champ.CNA(intensity=myLoad$intensity,pheno=myLoad$pd$Sample_Group)
代码过后，只会生成一些这样的图片：
图的大概意思就是，C这个疾病情况下，相比于正常人，在全基因上那些位置发生拷贝数变异。我从来没有用过这个功能，感觉精度根本不够，我就努力确保了它程序没问题，运转顺利。
3.9 细胞种类分离问题
这个堪称是我这个研究方向上目前全球在最努力攻关的问题……我做它快三年了，也完全没有实质性突破和进展，好在全球范围内好像也没有人做出来。简而言之是问题是这样的，人体内充斥着各种细胞，你给病人采血取样，其实取到的也是细胞的组合。然后问题就来了，你确定某个疾病是所有的细胞都出问题了吗？还是某几种细胞出了问题？但是你的数据是细胞们混合在一起的，你怎么分开？比如下面的公式：
X=C.F
这里的X
是你的身体中采集到了CpG甲基化值，或者基因表达值，或者各种乱七八糟的数值（只要不是基因序列本身，应该都存在这个问题吧，基因序列确实稳定，不会发生变化，这也就是为什么SNP测序可以发展成为产业，而其他的不可能。）。这个X其实是又两个部分组成的：C和F。C是每一个位点（或者基因）在单一细胞中的表达值，比如你的血液里有红细胞，白细胞和血小板，C就是每一个位点在这些细胞中的表达值矩阵，F
是你采集的样本中，各种细胞的比例。比如你的血液中红细胞，白细胞和血小板的比例。
这带来的问题就是。每个人体内的细胞比例是不同的。甚至于，有些疾病本身就是因为细胞比例发生变化导致的，血小板太少会导致流血不止对吧？进而，导致疾病发生的基因也是在不同细胞中的，如果他们混在一起，你怎么知道，是谁具体导致了癌症？其性质就像是之前在SVD的时候我提过的干扰因素，你找了两群人想找癌症和正常人的区别，结果一群人是老人，一群人是小孩，这怎么可能找的对？年龄还可以修正，只要你知道大家的年龄就可以修正。如果你找的100个样本血细胞混合是不同的，你怎么继续做研究，而且你也不知道大家的细胞比例是什么，连修正的办法都没有。
所以就是X
是你的数据，C是纯化过的单一细胞内的甲基化值，F是样本的细胞混合比例。X是C和F的矩阵乘。目的就是为了识别出F
。
这个问题还要分为两个方向，是关于C
的，很明显，在上边的算式中，C和F两个矩阵决定了最终的数据矩阵X，那么只要有一个，就能大概解出另一个。换言之，如果你知道一群人的数据里的细胞比例，那么你就可以推测出纯化过的细胞甲基化值。或者如果你知道纯化过的细胞甲基化值，我也可以推测出F
——人群的细胞比例。
上述这种情况已经有解，而且解很不错，Houseman教授的Refbase算法很好用，他的办法就是，在你知道C
的情况下，解开F
，然后该修正修正，该分析分析。
代码：
myRefBase<- champ.refbase(beta=myNorm,arraytype="450K")
1
该函数可以在已知C的情况下，解出F。效果很好，但是我也没有什么可以展示的，因为这毕竟不是一个什么可以可视化的过程。
真正困难的是根据X进行C和F的同时估测，这个到目前为止似乎没有什么太好用的办法。Houseman教授提出了替代变量发去将已知的一些变量替代为PCA估测出来的Component，并且默认这些Component中有细胞比例。这个感觉有道理，但是应该对数据质量要求很高，如果你还有其他可能的没有消除干净的变量，就会导致你的Component其实根本不是细胞比例……然后就错掉了。
他的函数我也集成进来了，但是不见得很好用：
myRefFree <- champ.reffree(beta=myNorm,pheno=myLoad$pd$Sample_Group)
1
4. 总结
大概就是觉得自己可以尝试开一个技术博客，记录一下平时用到的技术。这个项目是去年下半年做的一个小东西，不是什么正式项目，科研届不会在乎什么用户可视化的无聊软件的，花时间也不长。发在CSDA上主要是觉得Shiny和Plotly挺好用的，也许可以给对R语言有兴趣的同学一些启发和灵感。我学的也不好，尤其有些算法在深度和概念上理解可能有错，欢迎同学们指正。
最后总结几句：计算生物学真的不好做，对统计编程要求挺高的，而且很多技术可以与很多领域对接。比如最新方兴未艾的那个”Data Science“。
搞这行的人，至少接触过几个G以上的数据，这些数据说太大不至于，但是能把它们处理清楚，意味着他处理百万行以下的超小数据集是没问题的。
做生信统计严谨要求很高，每一个同学都必须搞清楚什么时候用Wilcox，什么时候用t.test()，都能知道correlation不等于因果，所以不会犯里约奥运会时候那种幼稚的错误：”里约奥运会是社交网络上被谈论的最多的一届！“（恐怕不是奥运会进步了，而是社交网络发展了）。
有些IT技术挺好的，但是一直进不到科研届来，我曾经需要跑一个数据，用R不可能跑完，用Python估计两三天，最后用了Spark，3分钟出结果……那个时候我就觉得，领域之间应该互相多学习学习。金融IT就业单位，不要看到挂着生物两个字的人，就推到门外，这其实可能是世界上最接近”大数据“和”数据科学“的专业了。
生物数据和金融数据差别能有多大呢？如果细胞识别算法能出来，是不是一只股票的投资维度分析也会发生变化？通信问题中的音频混合问题是不是可以被解决？Shiny和Plotly这个技术用于数据展示不也很方便吗？SVD分解针对各种因素的Correlation与社会科学家分析城市省份经济发展的方式应该是一致的吧？生物数据有干扰因素的性质，与海洋大气采集的数据干扰有没有共通性？问题往往是相通的，技术更经常是一样。