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写在前面
从2016年10月底开始，由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了，整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚，小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”以后，小编继续整理了第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”的听课笔记，今天是第四部分，分享给各位。
授课老师
这次课程的授课老师是来自复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士。我们知道，IBS的杨芃原老师实验室是中国蛋白质组学领域综合实力最强的团队之一，刘老师就是在这里获得了她的化学生物学博士学位，并在杨老师实验室工作十余年。作为实验室的骨干力量，她拥有非常丰富的蛋白质谱实验技能与经验，并从事基于生物质谱的蛋白质和多肽定量方法的应用和开发，精通iTRAQ、MRM、MRM-HR、SWATH等相关技术，参与发表相关论文30余篇。刘老师在授课中详细分享了她在蛋白质谱实验样品前处理方面多年积累的珍贵经验与心得，这样的学习机会实属难得！
（文中所有图片均来自刘晓慧博士的讲义，并获得发表授权。）
之前小编通过三篇推文给大伙儿详细分享了样品前处理的各个步骤，今天我们来一起了解一下样品前处理的最新方法及进展，感兴趣的小伙伴儿就请跟着小编一起来学习吧！
背景介绍
自从进入了精准医学时代，蛋白质组学的发展也朝着精准医学临床应用的方向在不断发展。
我们知道，在临床应用领域，常常需要用更多的样品量来进行研究分析，得到更多的结果。比如，用几十上百例的蛋白质组学样品来进行肿瘤分析。2014年Nature上发表过一篇文章，做了95例大肠癌的分析，通过label free结果对95例进行分型。与之前的ATGC方法把大肠癌分成四个型比起来，蛋白质组学的方法可以更精准地分成五个型。这也是蛋白质组学在精准医学领域一个很好的应用实例。（Bing Zhang, Jing Wang, et al, Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer，nature,2014,3,382）
接下来我们分享两种新方法，都可以实现简单、可重复且自动化的样品前处理效果。
StageTips
第一种方法最早发表于2007年，到今年已经成立了一家公司，将这种方法发展出来的装置很好地商业化了。
当时，整套装置还需要手工来组装。不过组装的方法也非常简单，根据上面的图，分五步走：
第一步:准备好一张3M的C18过滤膜，一个枪头，一个平口的针头和一个长手柄；
第二步+第三步：在3M膜上取出一个小孔的膜，
第四步：将膜捅到EP管里面，用气把它压紧了，形成一个小的膜系统。
第五步：取出手柄和针头，带膜的枪头就完成了。
C18过滤膜有脱盐的效果，可以把蛋白质或肽段截留在上面，通过水或BUFFER体系把盐洗掉，之后再通过有机相把肽段或蛋白从C18膜上洗脱下来。
除了C18膜，还有很多种类型的膜，比如强阳离子膜、阴离子膜等。大伙儿看看下面这个图，感受一下这些膜的名字和成分。
这里的柱状图是对比不同的膜处理后能鉴定到的肽段的数量，左图是肽段水平的鉴定，右图是蛋白水平的鉴定，差别都不太大（图里的fr1，2，3是指馏分）。通过这个膜系统，可以进行分级分离，也可以进行脱盐。
时间走到2009年，又出现了一种新的FASP（ filter-aided sample preparation）方法。之前的Stagetips只是为了进行分级和富集，而FASP可进行酶解（文献见下图）。
到了2014年，这个团队又将StageTips和FASP方法结合起来，实现了所有的实验都在这个小管子里完成，样品加入后先清洗，然后还原，清洗，烷基化，再清洗，最后酶解。酶解后的肽段一直留在下图的“Reaction chamber”里，然后将肽段通过下方的膜脱盐，洗脱，或者直接通过它进行馏分的分离，收集样品。
四次重复实验检测发现，用这种装置做下来，四次都能被重复的蛋白有92.9%，只有1.6%的蛋白是其中任意一次单独鉴定到的，1.5%是其中两次鉴定到的，4.0%是其中三次鉴定到的。如果我们考虑到这个实验一共鉴定到了9,667个蛋白（human proteins），在保证了较高的鉴定率的前提下，92.9%的四次重复率已经相当不错了！并且信号强度也比较一致。由于管子体积的限制，这套装置很适合少量样品的分析。
该方法已经商业化。2016年Cell Systems上发表了一篇用这套商业化的装置做的血液样品案例。如下图，把血液样品取出来后，直接加到装备了膜系统的EP管里。通过优化整个酶解系统，整个前处理过程2个小时之内就能完成，其中裂解与还原烷基化是同时完成的。完成之后通过一个自动化仪器，进入质谱，经过0.5小时的质谱实验，以及15分钟的结果分析，最后鉴定到了300多个常规的中高丰度蛋白（这个例子中没有对血液中的高丰度蛋白进行去除）。
同样的，文章里也对这次实验进行了重复性评估，见下图。
从图上看，鉴定的重复性特别好，尤其是49种FDA批准的Biomarkers中，有41种的CV值都小于20%，说明这些biomarkers可以通过该方法可重复地检测到。这个方法被认为很有希望发展为高通量样品处理的方案。
（Tips: CV值，Coefficient of Variation，反映数据离散程度的绝对值。在进行数据统计分析时，如果变异系数大于15%~20%，则要考虑该数据可能不正常，应该剔除）
以上是该公司的网址，有兴趣的小伙伴可以登上去看看。目前最新的进展是，重复性可以到0.99，样品处理时间缩短到了1个小时，再加上20分钟的质谱分析，总体实验时间得到了很好地控制，实现了简单快速高效且可重复的要求！我们期待这个方法能早时用到临床样品的检测上。
PCT压力循环系统
第二种新方法叫PCT压力循环系统。
刚才讲到，可以通过压力差来进行样品的破碎和蛋白的提取。另外，我们知道，在高压条件下，很多反应是会提高效率的，比如说酶解、还原烷基化、样品裂解等。下面这篇文章通过分析穿刺的样品（量非常少，大概只有1立方毫米），放到PCT装置里，通过样品的处理，还原烷基化，酶解，酶解之后脱盐，取出，直接进行SWATH分析。
我们来看下这种方法的结果评估。图示上方的a 图表明结果的SD（样品标准差）都很小，说明检测结果很精确；b图表明漏切的位点也很少.
图示下方的a图表明，可重复性CV值基本上都小于20%，只有其中两次的重复性实验中差异大了一点。
了9对胃癌
文章里用这个方法分析的癌症与癌旁组织，然后找到了一组蛋白成为癌症的潜在标志物。
以上是两种在蛋白质临床检测方面非常有前途的方法，都实现了快速、高通量、高重现性，自动化的处理，感兴趣的童鞋可以重点关注一下。
最后，我们对整个第二讲的内容进行一个小结，如下图：
通过以上的学习，你是不是对蛋白质谱实验的样品前处理过程有了一个基本的概念呢？当然，理论学习可以帮助我们迈出第一步，但这里面涉及着大量的实际操作，是需要亲自动手去做才会有更深的体会的。如果你在实际操作中遇到什么具体问题，欢迎留言哦~
蛋白质组学网络大课堂的第二讲“样品前处理”小编就分享到这里，特别感谢本次课的授课老师刘晓慧博士对推文内容的细心审核，也感谢所有陪小编一起学习进步的小伙伴们！