二代测序文库读长的影响因素-实验角度简介
一、现市场上，常见的文库长度种类
1)life的Ion Torrent平台：
该平台主要用于临床快速检测、产前诊断、疾病panl扩增子测序
PGM 测序仪：200bp、单端400bp、单端600bp（2017年发布）
Proton 测序仪：200bp
优点：测序时间短
缺点：通量低，价格较高
- illunima 测序仪平台全系列
该平台占二代测序市场主要份额，主科研服务，随着测序仪器升级，测序时间的缩短，开始向临床推广。
Miseq ：PE300 (向下兼容PE150)——目前illunima读长最长的测序仪器，常用于宏基因组16S双区扩增子测序
Hiseq 2500：PE250——长度较长，通量较Miseq大
Hiseq 3000、Hiseq4000、Nextseq 500：PE150
Hiseq Xten：PE150 （illunima的性能怪兽，10台测序仪器同时测序，数据量按T级别产出）
Novaseq ：PE150 （继Hiseq Xten的升级版，测序时间大大缩短至72个小时完成，单台含2个通道，最新的，S4芯片可以每个通道产出2T）
优点：通量大，测序质量高，性价比高
缺点：测序时间相对于life平台长，测序长度相对于三代平台短
总结：仪器的读长，决定了文库构建时的插入片段的长度，如PE150，则表示可以测通300bp之内的插入片段、PE300，则表示可以测通600bp之内的片段
二、测序实验对文库片段的影响因素——起始模板的片段化
- 判断是否要进行起始模板的片段化
1）如果模板的长度大于目前测序测序仪器的插入片段（>300bp或>600bp），则要进入片段化。
如基因组DNA（一般病毒>10k，细菌>4M,动植物>100M或上G）——用于细菌、真菌、动植物基因组测序
如mRNA、lncRNA（一般mRNA、lncRNA>2kb）——用于转录组、lncRNA测序
特点：
a. 文库构建的主峰呈正态分布，为保证所有样品都达到PE150，建库时，插入片段的主峰设为350bp，保证最大比例上，最短的序列也能达到300bp以上，可以获得更多的数据；
b. 该种建库方法，组学类型一般不需要overlap。
- 如果模板的长度小于目前测序仪器的插入片段（<300bp或<600bp），则不需要进行片段化。
如宏基因组的16SV4V5双区扩增子测序（扩增产物长度400bp）、ITS扩增子测序（扩增产物长度350bp）
如产前诊断、肿瘤诊断的游离DNA测序（DNA产物一般以核小体断裂单位，主峰为160bp）
如micorRNA测序、外泌体小RNA测序（miR长度一般为22nt）
特点：
a. 文库构建的主峰呈单一柱状分布，根据插入主峰的长度，选择建库类型，如PE150,PE300，保证所有长度都能测通。
b. 该种建库的方法，组学类型一般都要求，确保有overlap，可以将插入的片段信息，完整还原为单条tags，才正确统计信息（表达量、拷贝数）的生物学意义。
- 文库片段化的方法选择
物理法：
冷冻超声波打断法——随机性最好，低成本，几乎能兼容所有物种基因组片段化。（默认）
高Mg例子打断法——随机性较好，常用于转录组、lncRNA的片段化。（默认）
酶法：
DNA剪切酶——可能存在碱基偏好性，随机性较物理法差，操作快捷，用于基因组片段化。
RNA剪切酶——可能存在碱基偏好性，随机性较物理法差，操作快捷，用于转录组、lncRNA片段化。
转座酶法——不同的转座酶对物种的基因组大小，存在适用性。优点，可以一步同时进行片片段化和接头连接，操作快捷，常用于外显子测序、小型基因组测序（细菌）。
三、测序实验对文库片段的影响因素——建库的片段选择
- 目前的片段选择方法
DNA磁珠法（DNA建库）
RNA磁珠法、DNA磁珠法（建库时，RNA富集时使用RNA磁珠、经反转录后,DNA建库时，使用DNA磁珠）
注意：
a. 由于纯化磁珠的价格越来越低，技术也越来越成熟，目前建库进行片段时，均采用磁珠法，优点：回收率高，达80%以上，避免样品间污染，适合低浓度样品。
b. 目前市场上几乎不再采用切胶来进行片段选择，从2014年后，随着磁珠法的普及，切胶法建库及接近淘汰。缺点：回收率低、回收片段范围误差大，要求样品浓度高、极其容易出现样品污染、受环境污染。
切胶法的特例
a. 由于小RNA的含量低，建库后容易受到严重接头污染，且目标片段与接头举例非常近，磁珠法无法进行高精度片段选择，一般采用高分辨率的PAGE胶来进行切胶回收。
b. 对应靶标扩增的PCR产物存在严重杂带时，由于产物浓度高，条带清晰，可采用切胶法来进行目标片段回收。一般的宏基因组16S扩增，存在微量杂带时，使用磁珠法，便可以快捷回收。
- 片段选择的主峰设置及参数
a. 对于不需要进行片段化的文库类型，靶标片段的主峰，就是文库插入片段的主峰，直接采用对应的低浓度的磁珠参数，一步将短片段去除即可。（去除引物二聚体、接头二聚体、纯化）
b. 对于需要进行片段化的文库类型，为了保证最短的插入片段也能达到测序的读长，最大获取数据量，因此，一般设PE150为350bp的插入片段正态主峰。测序时，Read1、Read2各测150bp，双拼接后Read存在空位，不影响分析。
如果想让Read1、Read2拼接后存在overlap，则设PE150为220bp的插入片段正态主峰，保证最长的插入片段也存在overlap。
如果想让Read1、Read2拼接中间的空位较大点，则设PE150为500bp的插入片段正态主峰，不影响测序质量。如插入片段严重超过500，会影响illunima的桥式PCR成簇和测序质量。
- 片段选择的正态分布峰获取
a.首先，采用一步法参数磁珠回收，如去除200bp以上的所有片段，去除引物、接头二聚体，核酸由bufer溶液，转为存在于水溶液中。
b.然后，使用两步法参数磁珠回收。第一步（去除400bp以上的片段），使用磁珠从大向小吸附大片段，将非磁珠吸附的上清溶液转移作为下一步的起始模板。第二步（保留300-400bp的片段），使用磁珠从大向小吸附，在有限的磁珠量下，控制为仅能吸附目标的插入片段文库，小片段在上清中去除。最终获得正态分布的文库峰。
以上描述的均按插入片段长度来描述
案例:
以下为PE150文库峰（约插入片段350+120bp双接头=470）
