AFC标记多肽

多肽标记和修饰

目前多肽标记及修饰的内容非常多，广泛应用在多肽药物，多肽生物学，多肽抗体以及多肽试剂的研究中。目前应用广泛的有：非放射性核素标记（C13，H2，N15），荧光标记（FAM，FITC等），生物素标记，磷酸化修饰等。

1. 非放射性核素标记

目前在非放射性核素标记中，使用广泛的仍然是C13，H2，因为其使用安全，放射性小。现在有比较完全的非放射性标记的氨基酸，可以按照正常的多肽合成方法将标记好的氨基酸直接连接到多肽上。

2. 荧光标记

荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。因此，目前在生物学研究中荧光标记应用非常广泛，荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。

3. 生物素标记

生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。主要有用于标记多肽氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用，当然，也可以直接使用生物素也可以标记，因为其结构上有个游离的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法缩合，由于生物素的溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶剂增加溶解度。

4. 磷酸肽合成

磷酸肽在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或长肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。

常用修饰和标记

N端标记或修饰

N端乙酰化（AC）

N端生物素标记（Biotin）

N端脂肪酸修饰(Pal, Myr)

N端罗丹明标记(Rodamine B)

N-FITC

N-5-FAM

N-BODIPY FL

N-Merocyanine 540

HYNIC

C端标记或修饰

C端酰胺化

C-端生物素标记 (用赖氨酸侧链连接)

C-FITC (用赖氨酸侧链连接)

C-AMC

C-AFC

磷酸化标记

p-Tyr

p-Ser

p-Thr

环化

二硫键环肽（S-S）

多肽首尾酰胺环

多肽蛋白偶联

KLH偶联

BSA偶联

含特殊氨基酸

D-amino acids

Cit,Aib,Abu,Ahx

Lys(Ac)

Lys(Me), Lys(Me2), Lys(Me3)

MAP 复合抗原肽

MAP4 4分支

MAP8 8分支

MAP16 16分支

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