分子生物学中常用的试验方法

最近处理一些基因数据的时候会好奇这些数据是怎么得到的，数据可靠吗。今天在一本书上看到了一些常用的分子生物学试验方法，这才解开了心中的疑惑。晚上抽时间把看得东西总结一下。

首先介绍一个基本概念“核酸酶（nuclease）”。核酸酶就是生物学家手里的剪刀，用它能把DNA切成小段。核酸酶中最重要的一个子类叫做限制性内切酶（restrictionendonuclease），它生物学家手中最精确的剪刀，每一种限制性内切酶可以切开DNA中的特定序列。比如下图中蓝色的椭圆就是在大肠杆菌中找到的一种限制性内切酶，它可以GAATTC（这个序列很有意思，它对应的CTTAAG倒着读就是自己，这种结构叫做反向回文结构，很多限制性内切酶只识别这种序列）。我想比喻成剪刀就已经能够解释核酸酶的作用了吧，对DNA的操作都要使用它完成。

“克隆”的生物学定义是复制一段基因，我们平时听到的克隆羊、克隆人等是特别复杂的克隆。大部分克隆实验没有这么高大上，而是通过把一小片基因“剪”下来（用上面提到的限制性内切酶），然后“粘”到另一个寄生体上去，观察这小片基因在寄生体上的表现。比如下图中，我们就用同一种酶把质粒（plasmid）切开，并从大肠杆菌上切下来一片基因，然后把基因连接到质粒上去。实验证明吸收了新基因的质粒会发生明显变化（培养基从蓝色的变成白色的）。这个过程看着容易，其实还有很多需要考虑的细节，比如质粒必须要寄生在别的细菌上才能存活，那么怎么把质粒注射到别的细菌上去呢？融合质粒和基因片段的时候，多大的比例合适？（实验证明1:1不是最合适的，5:1左右才好）再比如并不是所有的质粒都吸收了基因片段，有些调皮的质粒会吸收别的质粒（反正切口契合~~）

无论做什么基因实验，都需要从生物体中提取出DNA并分析DNA序列。首先，在打碎的细胞残骸中，DNA已经和细胞内别的物质混在一起了，不容易取出来。怎么办呢？有两种办法，一种是电泳：DNA带有微量的负电荷，在培养基两端通电后DNA会朝向正电荷方向移动，另一种是用离心机，把细胞残骸装在试管里，放入高速离心机中转，最终各种物质由于密度不同就分开了。不管我们用什么办法拿到DNA分子之后，都需要分析DNA序列，拿到我们熟悉的A-C-G-T序列。办法也不难，就是我们提前做出来一些序列已知的DNA片段，拿他们当做探针去和需要测定的DNA序列配对。由于DNA严格遵循A-T和C-G配对，所以把探针的序列对应过来就是需要探测的序列了。

染色质免疫沉淀（ChromatinImmunoprecipitation, ChIP）

生物体内的化学反应特别复杂，就拿DNA和蛋白质来说，一方面，DNA编码生成蛋白质，可是另一方面，DNA只负责存储遗传信息，是“静止”的，无法自己完成编码生成蛋白质这个过程，这个过程需要蛋白质来完成。蛋白质需要识别出特定的DNA片段，然后附着在DNA链上，开启编码过程。于是就很有必要检查出各种蛋白质分别识别哪些DNA片段了。染色质免疫沉淀就是用来确定蛋白质-DNA附着关系的。

ChIP先把一种蛋白质附着在DNA链上，然后用只识别该种蛋白质的抗体把蛋白质“抓住”，然后把DNA打碎，分析出每小段DNA序列。由于我们知道抗体对应的蛋白质种类，于是也就知道了蛋白质和DNA片段的对应关系。