CLARIOstar ACU提供了在可控环境下进行细胞凋亡和细胞坏死的实时监测生理条件
多指标RealTime-Glo™ Annexin V凋亡和坏死分析试剂盒检测细胞凋亡时的磷脂酰丝氨酸外翻事件以及细胞坏死引起的细胞膜完整性丧失
简介
虽然细胞死亡是一个重要的、正常的多细胞因素动态平衡的结果，但往往在很多人类疾病中扮演不利角色。对靶向细胞毒性物质和细胞保护剂的了解将有助于对癌症、神经退行性疾病和其它一系列疾病的治疗。若要对疾病模型中，引起失调的因素以及外部刺激反应进行充分的了解，构建细胞死亡的作用机制及动力学分析过程很有必要。传统的实验方法往往存在耗时、耗费人力、代价昂贵且信息不完整的特点。
这里我们介绍一种实时监测细胞凋亡和细胞坏死的新方法。Promega公司新推出的RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒提供了一种简单的活细胞样本“加样-读数”的实时监测实验方法。而由BMG LABTECH公司生产的CLARIOstar ACU提供了实时、同时检测发光和荧光信号，并同时维持实验样品细胞所需的[O2]和[CO2]。两者的有机组合为您提供了一个完美的无人值守的解决方案：只需加样完成开始实验，则可完全由仪器自动实时检测所需的参数，您将不会错过任何条件变化引起的重要反应参数。
RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡检测
图1：RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒原理：两个Annexin V-萤火虫荧光素酶（NanoBiT™）亚基融合蛋白转染到细胞中且在健康细胞中不会产生发光信号。当与PS相结合时将生成完整的酶并产生发光信号。而细胞膜的完整性则用改良的细胞坏死检测荧光探针来检测。
磷脂酰丝氨酸（PS）位置的改变-从细胞膜内侧外翻到细胞膜外侧被认为是正常细胞进入凋亡状态的标志信号。多重分析中利用Annexin V结合于PS来检定细胞凋亡的开始。
RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒利用了两个Annexin-萤火虫荧光素酶（NanoBiT™）亚基融合蛋白并且只有与PS产生亲和时才形成有活性荧光素酶的特点。在两种融合蛋白亚基充足的情况下，完整酶的产生量实时报告了PS的外翻。而细胞坏死检测试剂则报告因细胞坏死引起的细胞膜膜完整性的改变。两者结合则构建了一个可实时监测的细胞死亡作用机制（细胞凋亡、原发性坏死或其它原因）。
材料和方法
RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒(Promega, Cat #JA1011)
CLARIOstar ACU（BMG LABTECH）
白色、透明或不透明底96孔板（Costar）
K562细胞（来自ATCC）
阴性选择自然杀伤细胞（NK）（来自Lonza）
其它试剂购自市场
RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析试剂盒中所有试剂都按照说明书进行准备和加样。
对于剂量响应实验，起始最大浓度为10 μM 的bortezomib进行8个梯度系列稀释，加入到接种有10,000细胞/孔的K562细胞中，实验包括药物溶剂对照处理（Vehicle treatment）和无细胞空白对照。
NK细胞的实验中，NK细胞用IL-15处理，然后按比率接种到K562细胞中。单独的NK细胞或K562细胞作为对照。利用CLARIOstar多功能酶标仪进行检测和培养，仪器设置如下。
结果和讨论
在加入bortezomib后的48小时中，每1个小时用CLARIOstar ACU进行发光和荧光的实时双重检测（49个循环）。图8中的PS-外翻响应（发光）领先于细胞坏死响应（荧光）表明治疗型蛋白酶体抑制剂达到预期的凋亡作用。
图2：同时检测PS阳性（紫色）和膜完整性（橙色）
图3说明可以从单一的试验中获得多个时间-剂量响应曲线。结果进一步说明了应答量中剂量和时间之间的关系。试验中同时获得相类似的结果用于测定继发性坏死引起的细胞膜完整性改变（数据没有列出）。
最后的实验探究了经过刺激的自然杀伤性细胞（NK）对靶细胞的先天性能力：参与并诱导了K562癌细胞的凋亡。实验在细胞混合后的两小时内每5分钟检测一次（25个循环）。数据表明PS-外翻和细胞死亡程度与NK细胞数量成正相关关系（数据没有列出）。
图3：不同时间点凋亡的剂量应答曲线。Bortezomib药物处理（n=4）后不同时间点的剂量应答曲线。作为凋亡信号的PS外翻信号在12小时处可被仪器检测到并且在12到24小时之间呈现明显增加的状态。发光信号大小表明了凋亡发生的程度。
图4说明了NK细胞对靶细胞的比例的增加与凋亡量也就是发光信号强度之间的关系。
图4：自然杀伤细胞活力分析。RealTime-Glo™ Annexin V细胞凋亡和细胞坏死分析结果表明在低效靶比时NK细胞也存在显著的杀伤力，且随着效靶比的增加而显著提高。
结论
结果表明一种新颖的分析方法和仪器的有机结合，开创了一种无人值守且可获得出色结果的细胞凋亡和细胞坏死研究解决方案。检测结果的实时自然属性让您轻松获得以往通过繁重的凋亡分析工作才能获得的有用信息。
参考资料
1. S.J. Martin et al. (1995) J. Exp. Med. 182, 1545-1556.
2. A. S. Dixon et al. (2016) ACS Chem. Biol. 11, 400-408.
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