学习小组Day7 笔记-测序原理及分类（徐擎昱）

基本名词
flowcell： 测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lanelane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
PE：pair-end，双向测序，双端测序，即一个片段，从正向和反向各读一次，2x150bp
SE：single-end，单向测序，单端测序，只读一次，1x150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
Barcode或"Index"：区分样本的标签，是一级序列
测序深度：测序得到的碱基总量(bp) 与基因组大小的比值，它是评价测序量的标志之一
测序覆盖度：基因组被测序得到的碱基覆盖的比例
数据量：所测到的碱基总数，1kb=1000bp
Fragment：一个DNA片段

测序原理

1. 早期测序，主要为Sanger法，为一代测序
   具体原理参考测序的世界

设置四个反应体系1-4，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP、一定比例的ddNTP（带有放射性标记的ddATP，ddCTP，ddTTP，ddGTP，分别对应1234体系，其结构中比脱氧核苷酸多脱掉一个氧，即不含羟基，无法在DNA合成过程中形成磷酸二酯键，因此可中断DNA链的继续合成）。假如扩增过程中ddATP遇到了T位点，就结合并终止。因此，最终结合的位点包括dNTP结合和ddNTP结合，但是一段时间内大量的ddNTP会结合完所有测序位点，只是结合次数多少的问题。
最后利用凝胶电泳和放射自显影只能看到带有荧光标记的ddNTP，利用电泳条带前后关系确定其排列顺序，再用A-T, T-A, C-G, G-C关系反转，就能知道测序序列。

由于第一代测序技术测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，故而在验证序列以及验证基因组组装完整性方面都是金标准。

2. 二代测序和三代测序
   
   

   各代基因测序技术参数对比.png

二代测序.png

---

参考和引用摘自生信星球第九期Day7生信入门班教程